ДНҚ-ның шектелуі

ДНҚ-ның шектелуі (лат. restrisio – шектеу) – дезоксирибонуклеин қышқылының тізбектерін ферменттік жолмен әр түрлі мөлшердегі нуклеотидтер тізбегі болып табылатын жеке фрагменттерге бөлу процесі,яғни ДНҚ рестрикциясы – рестрикциялық эндонуклеазалар   деп аталатын арнайы ферменттермен ДНҚ молекуласын кесу. Оның негізгі қызметі - жасушаны бөгде генетикалық материалдан, мысалы, бактериофагтардан және плазмидалардан қорғау.

Рестрикциялық эндонуклеазалардың үш түрлі класы бар. Олар бірнеше жолмен ерекшеленеді: құрылымы, пайдалану нүктелері. Бірінші класты рестрикциялық эндонуклеазалар генетикалық материалдың молекулаларын ерікті нүктелерде, ал екінші және үшінші кластардың ферменттері - қатаң анықталған жерлерде кеседі. Бұл жағдайда екінші класс эндорестрикционаздары бір сайттың ішінде, ал үшіншілері тану учаскесінің жанында әрекет етеді. Екінші класты рестрикциялық эндонуклеазалар жеке екі белокты құрылымға ие, бірінші және үшінші кластардан күрделі құрылымымен және гендік инженерия үшін қолдануға мүмкіндік беретін АТФ-тәуелділігімен ерекшеленеді. Екінші кластың ферменті екі белсенді бөлшектен тұрады: тек магний иондарымен бірге әрекет ететін метилазаларды өзгертетін рестрикциялық эндонуклеаза. 

 Эндогенді рестриктаза ферменті белгілі бір ДНҚ тізбегін – тану аймағын таниды. Көп жағдайда бұл палиндром, яғни оңнан солға және солдан оңға қарай оқығанда нуклеотидтердің орналасу реті бірдей. Мысалы, 3'-AGATCT-5 'немесе 5'-TCTAGA-3'. Фермент азотты негіздердің белгілі санымен берік байланысады, содан кейін молекуланың тізбектері қозғалған кезде, ыдыраған жерді «табады». Шектеу доғал және жабысқақ ұштардың пайда болуымен мүмкін.

Доғал ұштар ДНҚ тізбегін бір-біріне қарама-қарсы орналасқан байланыстар арқылы кесіп тастағанда пайда болады. Жабысқақ ұштар рестриктаза ДНҚ тізбегін бір-біріне қарама-қарсы орналаспаған байланыс арқылы кесіп тастағанда пайда болады.  3'-5 'Ал жабысқақ ұштары палиндромдардың асимметриялық кесілуіне байланысты қысқа және ұзын құйрықтардың (3'-, 5'-ұштары) түзілуімен сипатталады. Жабысқақ ұштары өзін-өзі толықтырады, яғни олар қосылған кезде құрылымды қалпына келтіруге қабілетті.

Рестрикация ферменттеріРестриктаза ферменті екі спиральды ДНҚ-ның ерекше реттіліктерін танып,сол жерде ДНҚ-ның екі жіпшесін ажыратады(3-тарауда). Ажырау бір-біріне қарама-қарсы болулары мүмкін, бұндай жағдайда олар аяқталған ДНҚ жіпшесін қалдырып кетеді де, бірнеше негіздер жұбына кез-келген бағытқа жылжып кетуі мүмкін, нәтижесінде ДНҚ жіпшесінің бір ұшы,қорғандарының үстінде «салбырап» қалады.   Сайттағы негіздер реттілігі, әдеттегідей палиндромды, яғни ДНҚ жіпшесінің 5 және 3ұштарына бірдей сәйкес келеді. Мысалы, EcoRI peстрикция ферменті, ДНҚ-ның қос молекуласының кай жерінде орналасады, алты жұп негіздерден тұратын 5'-GAATTC-3” ерекше палиндромдық реттіліктерін таниды (сурет 4.2). Фермент осы жерде ДНҚ-ны үзіктері төрт жұп негіздерден тұратын реттілігі GAATTC, гуанин мен көршілес аденин арасынан ыдыратып, ығыстырады, нәтижесінде екі бөлшек пайда болады, әрқайсысы бір жіпшелі төрт негіздерден, ұштарында 5' ААТТ 3' тұрады.Нақтылы рестрикация ферменті ДНҚ-ны ерекше және өндіре алатын ферменттер жиынтығына бөліп жібереді, олардың бөлінуі ферменттің әсер ету жиілігі мен ерекше орын позициясын көрсетеді.Мысалы рестриказа EcoRI ДНҚ-ның екі спиралын ерекше 5' GAATTC 3' реттілігінде бөледі. Орта  есеп бойынша 6 жұп негіздерден тұратын сайты бар фермент, EcoRI тәрізді, адам ДНҚ-сын әрбір 46 жұп негіздерден кейін бөлуі керек   . Іс жүзінде геном бойында негіздер құрылысына қарай бұл орындар осылайша бірдей бөлінбеген. Осылайша EcoRI ДНҚ-ны көлемі оншақтыдан көптеген жүз мың жұп негіздерге бөлшектейді: әрбір бөлшектің ұзындығы екі EcoRI тану реттілік сайттарының арасындағы ДНҚ санына қарай анықталады. EcoRI ферментімен өңделген ДНҚ-ның барлық молекуласы, шыққан тегіне қарамастан,ұштары бір-біріне ұқсас және бір жіпшелі. EcoRIферментімен өңделген кез-келген екі ДНҚ молекуласын құрамында 4 жұп негіздері бар комплементарлы ұштарын қосақтау арқылы іn vitro ДНҚ-лигаза ферментінің көмегімен бірге қосуға болады. Нәтижесінде, бір ұшы бір қайнар көзінен, екінші ұшы басқа қайнар көзінен шыққан ДНҚ-ның рекомбинантталған (қайта қалыптасқан) молекуласы қалыптасады (сурет 4.2). Рестрикация ферменті екі жіпшені бір жерде кескенімен, ДНҚ-лигаза оларды да ұштарын салбыратпай жалғай алады.