Поляризационный флуоресцентный иммунный анализ биологически активных веществ

Лабораторная работа

Тема: «Поляризационный флуоресцентный иммунный анализ (ПФИА) биологически активных веществ»

по дисциплине «Основы иммунохимии»

Екатеринбург

        2017

Цель: познакомиться с методом ПФИА на примере определения БАВ.

Теория.

Одной из разновидностей иммунохимических методов анализа является поляризационный флуоресцентный иммунный анализ (ПФИА) - современный метод анализа который за короткое время позволяет определить концентрации искомого вещества в мельчайших концентрациях.

ПФИА – это гомогенный иммунохимический метод определения веществ с использованием флуоресцентной метки, основанный на конкуренции определяемого вещества и трейсера (низкомолекулярного вещества, меченого флуорофором) за связывание со специфическими антителами и определения поляризации флуоресценции трейсера в составе иммунного комплекса.

Флуоресценция - это физический процесс нетеплового свечения вещества после поглощения им энергии возбуждения (один из видов люминесценции) Молекулы вещества способные флуоресцировать, поглощают свет, который переводит их из основного электронного состояния S0 в возбужденное состояние S1. Время жизни такого возбужденного состояния составляет 10-11 – 10-6с. Затем молекула теряет полученную избыточную энергию путем излучения, происходит обратный переход в основное состояние S0.

Суть явления поляризации флуоресценции заключается в следующем. При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующего образца также поляризовано. Поляризация – результат фотоотбора флуорофоров в соответствии с их ориентацией по отношению к направлению поляризованного возбуждения. Поляризация флуоресценции вещества в растворе, содержащего флуоресцентную метку, описывается уравнением Перрена:

[pic 1]

наблюдаемая поляризация, максимальная поляризация, R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура, среднее время жизни молекулы в возбужденном состоянии, вязкость растворителя, V – молекулярный объем флуоресцирующего вещества.[pic 2][pic 3][pic 4][pic 5]

Поскольку в поляризации флуоресценции важную роль играют размер и форма молекул, это позволяет контролировать процесс взаимодействия Аг-Ат. Поляризация флуоресценции трейсера в растворе близка к нулю. Взаимодействие трейсера со специфическим Ат и образование иммунного комплекса значительно большего размера, приводит к высокому значению степени поляризации флуоресценции (Рис.1).

[pic 6]

Метод ПФИА строится на конкуренции определяемого Аг и трейсера за ограниченное число сайтов связывания Ат. При отсутствии определяемого Аг в анализируемой пробе степень поляризации флуоресценции максимальна, т.к. все центры связывания специфических Ат заняты только молекулами трейсера (Рис. 2а). При наличии определяемого Аг, конкурирующего за обладание активными центрами Ат, степень поляризации уменьшается, потому что часть антигенсвязывающих центров антител занята Аг без флуоресцентной метки (Рис. 2б). Следовательно, при фиксированной концентрации Ат и трейсера степень поляризации флуоресценции будет обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе.

[pic 7]

Приборы для измерения поляризации флуоресценции

Измерение производят на приборах, оборудованных 2 поляризаторами и высокочувствительным детектором (Рис. 3).

[pic 8]

В кювету вносится анализируемая проба, трейсер и Ат. Затем кювету облучают поляризованным светом с длиной волны 485 нм (соответствует возбуждение флуорофора) и детектируют флуоресценцию при 535 нм. Рассчитывают поляризацию флуоресценцию по формуле:

[pic 9]

Iv – вертикальная составляющая (параллельная учу возбуждения), Ih – горизонтальная составляющая (перпендикулярная лучу возбуждения) флуоресценции.