Молекулалық генетикалық әдістер зерттелінетін ДНҚ

Ақпараттық блок

Молекулалық генетикалық әдістер зерттелінетін ДНҚ молекуласының нақтылы учаскесінің (аллель, ген) құрылымының ерекшеліктерін анықтауға бағытталған зерттеу әдістері болып табылады. Бұл әдістер ДНҚ және РНҚ молекулаларын тәжірибелік зерттеулерге негізделінеді. Қазіргі кезде молекулалық биология, генетика жетістіктері, адам геномын зерттеулер, молекулалық генетикалық әдістерін медицина практикасында кеңінен қолдануға мүмкіндік туғызды.

ДНҚ (РНҚ) үлгісін алу жасушадағы ДНҚ молекуласын бөліп алу не полимеразалық тізбектік реакция (ПТР) арқылы жинақтау. ДНҚ молекуласын кез келген ядролы жасушалардан бөліп алуға болады. Ол ағзаның біртұтас геномы болғандықтан оны геномдық ДНҚ деп атайды. Әдетте, ДНҚ молекуласын лейкоциттерден, хорион жасушаларынан, амнион сұйықтығының жасушаларынан, фибробласт культурасынан бөліп алады.Бір  рет талдау жасау үшін бірнеше нанограммнан бірнеше микрограмммға дейін ДНҚ қажет. Ол үшін 20-40 мг. хорион, 1мл қан,  5-10мг қолдан өсірілген жасушалар қажет.

Ауруларды дұрыс анықтау не гетерозиготалық күйін анықтау үшін геномның кішкентай фрагментін зерттеудің өзі жеткілікті, тек осындай фрагменттерді жеткілікті мөлшерде көшірмелеп көбейту (амплификация) қадет. Бұрын бұл процесс бірнеше саты арқылы жүргізілетін: рекомбинантты плазмида құрастыру, оны бактерия жасушасына енгізу, бактерияны көбейту, ДНҚ фрагменттерін бөліп алу. Қазіргі уақытта қажетті ДНҚ фрагментін полимеразалық тізбектік (ПТР) реакция арқылы жеп жеңіл жүзеге асады. Бұл реакцияны америка ғалымы К. Мюллис ашты.

ПТР ДНҚ ны амплификациялау, яғни көшірмелерін көбейту. Бірнеше сағат ішінде ДНҚ ның кез келген бөлшектерін (бір генге дейін) миллиондаған дана күйінде көбейтуге мүмкіндік береді. ПТР жүргізу үшін көбейтілетін ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер бірізділігін күні бұрын білу қажет. Зерттелінетін ДНҚ учаскесіеің 5 және 3 ұштарының нуклеотидтер бірізділігіне сәйкес 20-30 нуклеотидтен тұратын екі олигонуклеотидтік праймерлер (РНҚ ұйытқы) синтезделінеді. ДНҚ фрагментін амплификациялау процессі қайталанатын циклдардан тұрады: жылылықпен әсер етіп (94С) ДНҚ молекуласын жеке тізбектерге ыдырату (данатурациялау); бір тізбекті ДНҚның негіздеріне комплиментарлы праймерлерді байланыстыру (37С-68С); ДНҚ полмераза ферментінің қатынасуымен жаңа ДНҚ тізбегін синтездеу (72 С)

ДНҚ молекуласын фрагменттерге бөлшектеу (рестрикциялау) рестриктазалар арқылы ДНҚ молекуласын ұзынды қысқалы фрагментерге кесу. Рестриктаза қос тізбекті ДНҚ молекуласының 4-6 жұп нуклеотидтер бірізділігін танып кеседі де, фрагменттерге бөлшектейді.

ДНқ фрагменттерінің электрофарезі рестриктазалар арқылы кесілген фрагменттер агрозды не полиакриламидті гель бетінде өлшемдеріне қарай түрліше таралып үлестіріледі, яғни молекула массасы үлкен фрагменттер тез қозғалады. Электрофорез аяқталған соң ДНҚ фрагменттері гель бетіне әртүрлі орындарда орналасады. ПТР дан кейін ДНҚ фрагменттерін визуальді зерттейді, ол үшін агроздық гелде электрофорез жүргізеді. Содан кейін гельді этидий бромидимен өңдейді. Этидий бромиди ДНҚ мен байланысып, гель бетін ультракүлгін сәулесімен сәулелегенде, спектрдің қызыл учаскесінде жарқырау байқалады. Сол жарқыраулар зерттеуге қажет ДНҚ фрагменті болып табылады.

Адам геномы үлкен болғандықтан рестрикция нәтижесінде көптеген рестрикция фрагменттері түзіледі және оны электрофорезден кейін оларды этидий бромидимен бояғанда ультракүлгін спектрінде ДНҚ фракцияларының бәрі біркелкі боялады. Сондықтан, ДНҚ ның ерекше фрагменттерін бөліп алып зерттеу Саузерннің блот гибридтеу әдісі арқылы жүргізіледі. Бұл әдіс мына кезеңдерден тұрады.

Электрофорезден кейін гельді сілті ерітіндіге енгізеді, бұл кезде қос тізбекті ДНҚ молекуласы бір тізбекті болып ыдырайды

ДНҚ фрагменттерін буферлік ерітінді көмегімен нитроцеллюлозалы не нейтронды фильтрге ауыстыру. Ол үшін гель бетін фильтрмен және бір бума фильтрлеуші қағаздармен жабады. Капиллярлық эффект нәтижесінде гель бетіне перпендикуляр буферлік ерітінді ағыны пайда болады. Гельден бөлініп шыққан ДНҚ фрагменттерінің бәрі фильтрде ұсталынып қалады. ДНҚ фрагменттерінің фильтрде орналасу реті олардың гельдегі орналасуына дәлме дәл болады.