Максам-Гильберт бойынша химиялық деградация әдісімен ДНҚ секвенирлеу әдісі

Қазақстан Республикасының білім және ғылым министрлігі әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университеті

                                                         [pic 1]

Факультеті: Биология және Биотехнология

Кафедрасы: Биотехнология

              Реферат

Тақырыбы: Максам-Гильберт бойынша химиялық деградация әдісімен ДНҚ секвенирлеу әдісі

                                                  Орындаған: Оразәлі Бексұлтан

                                                               Тексерген: Тайпақова С. М.

Жоспары:

I.Кіріспе

II.Негізгі бөлім

2.1 Максам-Гильберт әдісі

2.2 Сэнгер әдісі

III.Қорытынды

IV.Пайдаланылған әдебиеттер тізімі

Секвенирлеу бұл – нуклеин қышқылдарынының нулеотидтік ретін анықтау әдісі. Жоғары эфиктивті секвенирлеу әдісінің пайда болуына көптеген әдістердің бірігуі әкеп соқты, солардың ішіне келесі әдістер жатады:

• Елеулі орын алатын әдістің бірі бұл электрофорез әдісі, бұл әдістің дамуы не бәрі 1 нуклеотид ұзындығы болатын олигомерлерді бөлуге мүмкіндік берді.
• Азотты негіздердің спецификалық химиялық модификация әдісі.
• P 32 изотопы арқылы ДНҚ тізбегіндегі ақырғы (концевых) нуклеотидтердің радиоктивті таңбалау әдісі.
• ДНҚ тізбектерін ДНҚ полимеразамен көшіру әдісі.

ДНҚ секвенирлеудің екі негізгі әдісі бар: химиялық және ферментативті.

 Химиялық әдіс немесе Максам Гилберт бойынша химиялық әддістің негізінде ДНҚ-наң қылқан учаскалерін химиялық әсермен ыдырату жатыр.Тек бір- біріне қарай жүреді (3'немесе 5'). Реагенттің концентрациясы мен әсер ету ұзақтығы тек бір үлгідегі (Ц; Ц+Т; Г; Г+А) нуклеотид тер модификацияланатындай етіп таңдаллоды.учаскалер бойынша бөлу агарозды ісі 1976 жилы Аллан Максам және Уолтер Гилберт әзірлеген. гельде электрофорез көмегімен жүргізіледі.

ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтаудың екінші тәсілін Нобель сыйлығының екі дүркін лауреаты атанған ағылшынның атақты ғалымы Ф. Сэнгер ұсынды. Сэнгер әдісінің көп жақтары Максам-Гильберт әдісімен ұқсас болғанымен оның принципінің айырмашылығы бар — Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтау ДНҚ-полимераза яғни ДНҚ-ны ажырататын емес, керісінше оны синтездейтін фермент көмегімен іске асады. Мұнда ген үзіндісінің өзі емес, ДНҚ-полимеразаның көмегімен синтезделетін ДНҚ молекуласы зерттеледі. Ферменттің әсерімен ұзындығы әр түрлі ДНҚ молекулалары синтезделеді, олардың 5’— ұштары бірдей, ал 3’— ұштары төрт азоттық негіздің (А, Т, Г немесе Ц) бірі бойынша әр түрлі.

[pic 2]Сэнгер әдісі 1-сурет

Сэнгер әдісінде нуклеотидтер қатары белгісіз ДНҚ сегментін М1З бактериофагының ДНҚ-сынан құрастырылған арнайы векторға енгізеді. Біз бұл фагтың векторлық молекула ретінде ыңғайлы айырмашылығын жоғарыда қарадық, атап айтқанда генді жалғыз тізбекті күйде тасымалдай алады. Мұндай тізбектің нуклеотидтер қатарын анықтау оңай. М1З бактериофагының ДНҚ-сы қос тізбекті күйде де бола алады.

 Осындай фагтың негізінде бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы үшін оның геномының маңызды емес аймағына шамамен ондаған әр түрлі рестриктазалар үзе алатын полилинкер жалғанады. Полилинкердің қатарына 17 н. ж. құралған тізбек жалғанады. Осындай векторды рестриктазалардың бірімен үзгеннен кейін оны талдауға алынған және сол рестриктазамен үзілген ДНҚ бөлігімен біріктіреді. Мұнда ол вектордың 17 мүшелік тізбегімен қатар орналасады. Міне осындай рекомбинантты ДНҚ-ны бактерия клеткасына енгізіп, одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар фагтарды алады. Енді фагтан ДНҚ-ны айырьш, оны талдауға кірісуге болады.