Розробка технології отримання препаратів глутатіону на основі сконструйованих активних суперпродуцентівцього трипептиду у дріжджів Hansen

За допомогою метаболічної інженерії сконструйовано штам метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з посиленою експресією генів GSH2, що кодує γ-глутамілцистеїнсинтетазу, та MET4, що кодує транскрипційний активатор генів біосинтезу цистеїну (попередник синтезу глутатіону). Отриманий рекомбінантний штам характеризується підвищеною продуктивністю синтезу глутатіону порівняно із штамом дикого типу в лабораторних умовах. Було проведено оптимізацію синтезу глутатіону сконструйованого рекомбінантного штаму H. polymorpha.

Глутатіон (γ-L-глутаміл-L-цистеїніл-гліцин, GSH) — це біологічно активна речовина пептидної природи, що відіграє важливу роль у широкому спектрі клітинних реакцій. За рахунок наявності тіолових груп глутатіон у клітині виступає як донор електронів та забезпечує перебіг реакцій відновлення, при цьому він переходить в окислену форму (GSSG). Глутатіон задіяний у детоксикації ендогенних та екзогенних металів і ксенобіотиків, депонуванні та транспорті цистеїну, біосинтезі білка та ДНК, транспорті амінокислот, які є важливими метаболітами для росту клітин еукаріот, регуляції клітинного циклу та ін. Глутатіон є кофактором ряду ферментів і основним джерелом азоту і сірки в умовах їх виснаження в навколишньому середовищі. Також він відіграє важливу роль у захисті організму від бактерій, паразитів та вірусів. Дефіцит глутатіону в людини асоційований з рядом медичних розладів, викликаних оксидативним стресом, отруєнням або послабленою імунною системою. Ці порушення включають нейродегенеративні захворювання, рак, катаракту, цироз печінки, захворювання легень, запалення шлунково-кишкового тракту і підшлункової залози та гемолітичну анемію.

Біотехнологічне виробництво глутатіону здійснюється з використанням ензиматичних методів або шляхом ферментації природних чи генетично модифікованих мікроорганізмів, таких, як Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Escherichia coli, Lactoccocus lactis. Термотолерантні метилотрофні дріжджі H. polymorpha з природньо високим вмістом глутатіону та стійкістю до різних видів стресу розглядаються як перспективний об’єкт для конструювання конкурентного продуцента цього трипептиду. Для цього виду дріжджів детально розроблено підходи метаболічної інженерії.

Застосування методів метаболічної інженерії дало змогу одержати рекомбінантні штами H. polymorpha з підвищеною продуктивністю синтезу глутатіону. Зокрема встановлено, що посилення експресії як гену GSH2, що кодує γ-глутамілцистеїнсинтетазу, так і MET4, що кодує транскрипційний активатор генів біосинтезу цистеїну (попередник синтезу глутатіону), стимулює синтез глутатіону у метилотрофних дріжджів H. Polymorpha.

У роботі використано стандартні молекулярно-генетичні методи. Біомасу дріжджів визначали спектрофотометричним методом на спектрофотометрі Helios γ (λ = 600 нм, кювета 1 cм), розраховуючи суху вагу за калібрувальною кривою. Оптичну густину