ПТР әдісі

[pic 1] Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық университеті[pic 2]

Молекулалық биология және генетика кафедрасы

СӨЖ

Тақырыбы: ПТР әдісі

Қабылдаған:Алтыбаева Н.А

  Орындаған: Нұрқал Айбота

Алматы-2020ж.

Мазмұны:

• Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР, PCR) 
• ПТР-ге қажетті компоненттер
• ПТР анализдің кезеңдері
•  ПТР-ге арналған құрылғылар
• Нақты уақыттағы ПТР
• ПТР әдісінің артықшылықтары мен кемшіліктері
• Қорытынды
• Пайдаланған әдебиеттер

Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР, PCR) 

• Әдіс жасанды жағдайда (in vitro) ферменттерді қолдану арқылы ДНҚ нуклеин қышқылының белгілі бір аймағын бірнеше рет таңдап ферментативті көшіруге негізделген. Бұл жағдайда көрсетілген шарттарға сәйкес келетін бөлім ғана көшіріледі, егер ол зерттелетін үлгіде болса ғана.
• Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) әдісінің бастапқы принципін Кэри Мюллис 1983 жылы жасаған. ПТР ашылуы молекулалық биология саласындағы ең көрнекті оқиғалардың бірі болды, ал Кэри Муллис ПЦР анализін дамытқаны үшін химия бойынша 1993 жылы Нобель сыйлығына ие болды.
•     ПТР-НЫҢ ЖҮРУІ ҮШІН ҚАЖЕТ КОМПОНЕТТЕР: 
  1)Зерттелетін фрагменті бар ДНҚ молекуласы.
• 2) ДНҚ-полимераза, яғни ДНҚ-ның көшірмелерін жасауға арналған фермент. ПТР процедурасы бірнеше жоғары температуралық сатыларды қамтиды, сондықтан термостабильді ДНҚ-полимеразалар қолданылады; олар 90 ° C дейінгі температурада ыстық бұлақтарда тұратын ыстыққа төзімді бактериялардан бөлінеді; көбінесе бұл Thermus aquanticus бактерияларының Taq полимеразы.
• 3) ДНҚ синтезі үшін ДНҚ-полимераза қолданатын нуклеотидтердің қоспасы.
• 4) ПТР праймерлері - зерттелген ДНҚ аймақтарына ұқсас жасанды синтезделген жұп олигонуклеотидтер (мөлшері 15-тен 30 нуклеотидтік жұпқа дейін).

[pic 3]

ПТР-ге арналған құрылғылар

    ПТР процесі бірнеше түрлі температурадағы циклдарды үнемі өзгертуді қажет етеді.

 ПТР-ге арналған заманауи құрылғылар - термопроциклдер - берілген программа бойынша реакция қоспасының температурасының тез өзгеру режимінде жұмыс істейді және бірнеше сағат бойы ДНҚ фрагментін күшейтуге (көбейтуге) қабілетті.

[pic 4]

ПТР-талдауға арналған аспаптар

Амплификатор Mastercycler® X50 ПТР оңтайландыру үшін жетілдірілген мүмкіндіктері арқасында молекулалық биология саласындағы озық зерттеулер үшін тамаша күшейткіш болады.

Нақты уақыт режиміндегі күшейткіш Agilent Stratagene

MX3005P  негізгі ерекшелігі-полимеразды тізбекті реакция өнімдерінің жинақталуын бақылау және сандық талдау, сонымен қатар нәтижелерді автоматты түрде тіркеу және түсіндіру.

ДНҚ амплификаторлары (термоциклерлер) "классикалық«

Амплификатор (ДНҚ-амплификатор, циклер, термоциклер) – қазіргі заманғы молекулярлық генетиканың негізгі әдісі - полимеразды тізбекті реакция (ПТР) жүргізуге арналған аспап.

ПТР анализдің кезеңдері::

1. ДНҚ бөліп алу  - реакцияның «тазалығына» кедергі келтіретін органикалық заттарды (липидтер, амин қышқылдары, пептидтер, көмірсулар, ақуыздар мен полисахаридтер) еріту үшін ДНҚ немесе РНҚ молекулаларын оқшаулауға және ерітуге арналған реактивтермен диагностикалық материалды арнайы өңдеу. ДНҚ шығаруға кететін уақыт инфекциялық қоздырғыштың түріне және тексерілетін материалға байланысты. Мысалы, ДНҚ-ны қаннан бөліп алу үшін 1,5-2 сағат қажет.

2) ДНҚ денатурациясы. Ол үшін реакциялық қоспаны 92-95 ° С дейін қыздырады, нәтижесінде екі тізбекті ДНҚ молекулалары оралып, екі тізбекті екі молекула түзеді. Бұл процесс кем дегенде 1 минутты алады.

3) Праймерлерді күйдіру. Бұл кезеңде қоспаның температурасы 54 ° C дейін төмендейді. Праймерлер бір тізбекті ДНҚ-ға бекітіледі.

4) Элонгация  (синтез). Реакциялық қоспадағы температура Taq полимеразаның оптимумына + 75 ° C дейін жеткізіліп, комплементарлы ДНҚ тізбегінің синтезі басталады.