Определение активности α-амилазы, полученной из различных источников

Курс «Основы энзимологии»

Лабораторная работа №1 (v.2025-01).

Определение активности α-амилазы, полученной из различных источ- ников.

Предварительная подготовка:

Найти информацию по свойствам альфа-амилазы из слюны и других источниках, ее субстрату, предложить способ расчета концентрации субстра- та, учитывая неопределенную длину полимеров крахмала и множественность сайтов расщепления.

Необходимо знать способы расчета активности ферментов, молярных масс, молярных концентраций, использование регрессии (линейной, линей- ной в логарифмических координатах, степенной, квадратической, кубиче- ской) для расчетов концентраций по калибровочным кривым.

Освежить знания по фотометрии (закон Ламберта-Бера), подходы к ис- пользованию калибровочных кривых.

Материалы исследования, реактивы и расходные материалы.

1. Слюна, собранная в стакан.
2. Проросшие семена: фасоли, пшеницы (по 5-10г).
3. Раствор крахмала-индикатора 0,075 %.
4. Фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,0 (ФСБ): раствор NaCl 0,87% с фосфатным буферным раствором.
5. Йодный реактив (Раствор йода 0,1% в йодиде калия 0,2%) (D400 = 0,22

± 0,01).

1. Вода дистилированная (деионизированная).
2. Наконечник 1000 мкл – 3 шт.
3. Наконечник 200 мкл – 3 шт.

Приборы.

1. Спектрофотометр или ФЭК со светофильтром 670 нм (красный).
2. Кюветы с l=10 мм.
3. Центрифуга.
4. Весы.
5. Термостат 37°С
6. Вортекс (перемешиватель).
7. Дозатор п/а 1000 мкл
8. Дозатор п/а 200 мкл
9. Груша с силиконовой трубкой - 5 шт
10. Штатив для пробирок пластиковый – 5 шт.

Посуда

1. Ступка с пестиком – 1 шт.
2. Стакан стеклянный или пластиковый 50-100 мл – 1шт.
3. Пластиковые пробирки 15 мл – 2 шт.
4. Пласт или стекл пробирки с пробкой 15-20мл – 16 шт.
5. Пробки для стеклянных пробирок – 16 шт.
6. Пипетки стекл 2 мл – 3-5 шт.
7. Пипетки стекл 5 мл – 6 шт.

Цель работы:

Продемонстрировать сходную активность фермента, полученного из различ- ных природных источников.

Задачи работы:

1. Собрать материал для исследования.
2. Провести необходимые экспериментальные работы.
3. Выбрать метод расчета активности.
4. Рассчитать активность α-амилазы в слюне человека.
5. Рассчитать активность α-амилазы в семенах растений.
6. Сравнить активность α-амилазы, полученной из различных источников.
7. Сделать выводы.

Принцип метода:

Амилазы широко распространены в природе. Весьма активная амилаза содержится в прорастающих семенах гороха, фасоли, пшеницы, ячменя и др. Важная роль данного фермента в жизни растений заключается в том, что с его участием такое запасное органическое вещество как крахмал из нерас- творимой формы превращается (с участием еще ряда ферментов) в раствори- мые сахара, которые легко транспортируются в точки роста. Кроме того, амилаза является распространенным пищеварительным ферментом живот- ных, который позволяет переваривать полисахариды растительного и живот- ного происхождения.

α-амилаза (1,4-α-d-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.1) слюны является кальций-зависимым ферментом и относится к классу гидролаз. Катализирует гидролиз α-1,4 гликозидных связей в крахмале (амилозе) и гликогене, что приводит к расщеплению субстрата и появлению дисахарида мальтозы. Йод образует с крахмалом клатратные комплексы (амилойодин и амилопектойо- дин), окрашенные в синий цвет. Определяя убыль субстрата (крахмала) с по- мощью реакции с йодом, можно оценить активность фермента амилазы. Сте- пень окрашивания и поглощение при 600-700 нм прямо зависит от концен- трации крахмала и, соответственно, обратно зависит от активности фермента.