Агарозды гель электрофорез әдісі

Осы жалпы фармакопеялық мақала ДНҚ фрагменттерінің мөлшерін анықтауға, сондай-ақ оларды мөлшері мен формасы бойынша бөлуге арналған АГАРОЗДЫ гельдегі ДНҚ электрофорез әдісіне қолданылады (егер ДНҚ екінші құрылымдарды, мысалы, түйреуіштерді құраса).

Агарозды гельдегі ДНҚ электрофорез әдісі - "Электрофорез" ОФС-да сипатталған аймақтық электрофорездің бір түрі.

Әдістің мәні мынада: ДНҚ молекулалары теріс зарядталған, электр өрісінің әсерінен теріс электрод - катодтан (-) оң электрод - анодқа (+) ауысады. Тұтқыр орта бола отырып, агарозды гель макромолекулалардың - ДНҚ үлгілерінің алға жылжуына жол бермейді, осыған байланысты ДНҚ-ның қысқа фрагменттері анодқа ұзынға қарағанда тезірек қозғалады. Қоршаған ортаның рН-на аз тәуелді нуклеин қышқылдарының зарядының олардың массасына қатынасы бірдей, сондықтан агарозды гельдегі электрофорез әдісі әр түрлі ДНҚ фрагменттерінің мөлшерін ғана анықтауға мүмкіндік береді.  

Агарозды гельде электрофорез жүргізгеннен кейін эксперименттің мақсатына байланысты одан әрі зерттеу аналитикалық және/немесе дайындық болуы мүмкін.

ДНҚ молекулаларының электрофоретикалық бөлінуінен кейінгі аналитикалық зерттеуде алынған нәтижелерді кейінгі визуализация және талдау жүргізіледі.

Дайындық зерттеуі гельден бөлінген компоненттерді бірнеше әдісті қолдана отырып алу үшін қолданылады: агарозды гель буферлік ерітінділермен элюцияға ұшырайды, центрифугаланады, қатып қалады және ериді және т. б.

Агарозды гель электрофорез әдісі

Талдау жүргізуге дайындық

Тегіс бетке гельді құюға арналған пішінді орнатыңыз. Пішіннің түбіне тигізбестен (1-2 мм) тарақтар бір-бірінен 5 см қашықтықта немесе ND-де көрсетілгендей орналастырылады.

Буферлік ерітінділерді дайындау

Буферлік ерітінділерді дайындау үшін әдетте агарозды гельдегі электофорез әдісі үшін реагенттер жиынтығына кіретін дайын қосылыстар қолданылады.

Агарозды гельдегі электрофорезге арналған буферлік ерітінділерді дайындау үшін, әдетте, электрофорезге және гель дайындауға арналған камераны толтыру үшін жеткілікті көлемде трис-Борат - ЭДТА (TBE) немесе трис-ацетатты буферлік ерітінді (TAE) пайдаланылады. Нормативтік құжаттамада көрсетілген басқа қолайлы буферлік ерітінділерді пайдалануға болады. Электрофорезге арналған буферлік ерітіндіні (18 – 25) оС температурада 1 апта бойы немесе (2 - 8) оС температурада 1 ай бойы сақтауға болады.    

Үлгілерге арналған буферлік ерітіндіге арнайы таңдалған бояғыш қосылады. Бояғыштың болуы үлгілерді тесіктерге енгізуді жеңілдетеді және нақты уақыт режимінде ДНҚ фрагменттерінің гельінде жылжуды байқауға мүмкіндік береді. Алайда, бояудың шамадан тыс мөлшері ультракүлгін зерттеу кезінде фрагменттерді байқауға кедергі келтіруі мүмкін. Бояғыштар ретінде мыналар қолданылады: бромфенол көк, ксиленцианол, крезол қызыл немесе OrangeG. Агарозды гельдің әр концентрациясы үшін электрофорездің оңтайлы шарттары үшін белгілі бір бояғыш және оның концентрациясы таңдалады.

Гельді дайындау

Микротолқынды пеште немесе су моншасында агарозды гельді дайындау үшін гельдің қайнауына жол бермей (15-20 минут ішінде) агароза, буферлік ерітінді мен су қоспасының қажетті мөлшері мөлдір күйге дейін ерітіледі. Балқытылған қоспаны 50-60 оС температураға дейін салқындатады, одан әрі Автоматты дозатордың көмегімен соңғы концентрациясы 0,5 мкг/мл дейін бромды этидий қосады, мұқият араластырады және қоспаны жұқа қабатпен (5 мм-ге дейін) тарақтың тістері ауа көпіршіктерінің пайда болуына жол бермей, кемінде 3 мм батырылатындай етіп пластинаға құяды. Гель 18-25 оС температурада 30-60 минут бойы толық қатайғаннан кейін пайда болған тесіктердің зақымдануын болдырмай, тарақтарды жоғары қарай бірқалыпты қозғалыспен абайлап шығарып алады.