Культивування CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM для одержання бутанолу

Культивування   CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM для одержання бутанолу

Цільовий продукт -  мутантний штам з підвищеним накопиченням бутанола за допомогою хімічного мутагенезу (мутаген – N-метил-N-нітро-N-нітрозогуанідин) для культивування на заторі біомаси дротовидного проса.

У зв’язку з зменшенням запасів викопних ресурсів, з постійним коливанням їх вартості, екологічними проблемами і жорсткими нормами законодавства у сфері довкілля до виробництва хімічних речовин і палива з відновлювальної сировини зростає інтерес. Одним з прикладів такого виробництва є виробництво бутанола в процесі ацетон-бутанол-етанол (AБE) ферментації. Виробництво бутанола складається з декількох етапів. У біомасу для AБE бродіння, що складається або з крохмалю, або цукрів чи лігноцелюлозної сировини попередньо оброблюють і використовують як субстрат. Способи попередньої обробки відрізняються залежно від типу біомаси. Після ферментації кінцевий продукт екстрагують і очищують. Економіка біотехнології значною мірою залежить від вартості процесу бродіння і вартості субстрату. Для бутанола, як альтернативного виду палива, суттєве значення має сировина біомаси, яка має бути широко доступною і низькою вартісною.

Промислове виробництво бутанола шляхом AБE ферментації на даний час не економічне через низьку продукцію бутанола, низьку швидкість ферментації, складне виділення продукту і проблеми з виродженням штамів у процесі виробництва і фаговими інфекціями.

При АБЕ ферментації бактерії C. acetobutylicum на першому етапі виробляють масляну, пропіонову, оцтову та молочну кислоти (стадія утворення кислот), потім рН знижується та починається стадія синтезу розчинників – бутанола, ацетона, етанола та ізопропанола [8]. Ця стадія пов’язана з підвищенням концентрації масляної кислоти та зниженням величини рН менше за п’ять. Виробництво бутанола лімітується (блокується ріст мікроорганізмів) за концентрації бутанола 1–2 % [9, 3, 5]. Для оптимізації процесу отримання метаболітів необхідно провести первинну селекцію штамів-продуцентів; змінити відповідним чином генетичні структури штаму-продуцента для збільшення накопичення бутанола і визначити оптимальні технологічні параметри (рН, температуру, потреби у поживних речовинах) та режими живлення і накопичення біомаси; вибрати спосіб іммобілізації клітин-продуцентів [2, 6, 7]. Одним із методів отримання високопродуктивних штамів є використання мутагенезу [3, 4, 14]. Мутагенез клостридій досліджувався в роботах [12, 14], де показано неефективність ультрафіолетового та радіаційного опромінення. Показано, що мутантні штами, які мали високу амолітичну активність та підвищену толерантність до бутанола мали високий вихід цільового продукту [10].

Таким чином, виходячи із необхідності вдосконалення біотехнологій, що існують, та розробки нових біотехнологій отримання біобутанола, поставлена мета отримати мутантний штам з підвищеним накопиченням бутанола за допомогою хімічного мутагенезу для культивування на заторі біомаси дротовидного проса.

Об’єктами дослідження були культура C. acetobutylicum ІМВ В-7407 (IFBG C6H) з «Колекції штамів мікроорганізмів та ліній рослин для харчової і сільськогосподарської біотехнології» ДУ «Інституту харчової біотехнології та геноміки» НАН України, яка була виділена з ґрунтів і мулів озер міста Києва, та її мутанти; біомаса дротовидного проса Panicum virgatum L., отримана з Національного ботанічного саду імені М.М. Гришка.

Для активації культур використовували середовище Виноградського та скибки картоплі натерті крейдою [6]. Як ензиматичне середовище використовували затор із дротовидного проса з різною концентрацією сухої рослинної біомаси (від 20 до 100 г/л). Для визначення чистоти культур використовували модифіковане середовище Виноградського (ВМА) [7]. Для аналізу культуральної рідини використовували газову хроматографію (ГХ) [7].

Культивування мікроорганізмів на щільних середовищах проводили у анаеростат «АЭ-01» (Росія) в атмосфері азоту. Для забарвлення джгутиків використовували метод Лефлера з модифікацією наведеною в роботі [3]. Середовища Гіса з індикатором Андреде використовували для встановлення зброджування цукрів. Для ідентифікації місця положення спор у клітинах було застосовано метод забарвлення спор [3].