Сілтілі лизис жолымен плазмидалық ДНҚ молекуласын бөліп алу әдісі

Абилхаер Зере БТ18-44топ

10 -зертханалық сабақ

1. Сілтілі лизис жолымен плазмидалық ДНҚ молекуласын бөліп алу әдісі.

Сілтілі лизис немесе сілтілі экстракция - бұл молекулалық биологияда плазмидті ДНҚ-ны бактериялардан оқшаулау үшін қолданылатын әдіс.

Әдіс. Қызығушылық плазмидасы бар бактериялар алдымен өсіріледі , содан кейін үлгі жасуша материалын (ДНҚ-ны қоса ) оның құрамындағы ыдыстың түбіндегі тұнбаға шоғырландыру үшін центрифугаланады. Супернатант тасталады, содан кейін тұнба ЭДТА бар физиологиялық буферде қайта тоқтатылады . EDTA мақсаты ДНҚ-ны бұзатын ферменттердің жұмыс істеуі үшін қажет mg 2+ және Ca 2+ сияқты қос валентті металл катиондарын хелаттау, сонымен қатар ДНҚ фосфаты мен жасуша қабырғасын тұрақсыздандыруға қызмет етеді. Буфердегі Глюкоза жасушаның жарылуын болдырмау үшін жасушаның осмотикалық қысымын ұстап тұрады. Буфердегі Трис жасушаның рН-ын 8,0-ге дейін сақтайды, ал Рназа РНҚ-ны алып тастайды, бұл экспериментті бұзады.

Натрий додецил сульфатының детергентінен (SDS) және натрий гидроксиді (NaOH) сияқты күшті негізден тұратын күшті сілтілі ерітінді дайындалады және қосылады. Алынған қоспасы бірнеше минут инкубацияланады. Осы уақыт ішінде детергент жасуша мембраналарын бұзады және сілтінің хромосомалық және плазмидтік ДНҚ-мен байланысуына және денатурациясына мүмкіндік береді. SDS көмегімен жасуша мембранасын бұзғаннан кейін жасуша құрамы NaOH-ны бейтараптандырады; сондықтан лизис РН 12,8-ден 12,3-ке дейін төмендейді. Осылайша, егер бактериялық жасушалар жеткіліксіз болса, қосымша NaOH ДНҚ-ның кішкене фрагменттерін шығарады. Бірақ тұрақты РН қамтамасыз ете алатын 0,5 м l-аргининді 0,1 м натрий гидроксидін ауыстыруда қолданады.

Соңында калий ацетаты қосылады . Бұл ерітіндіні қышқылдандырады және плазмидтік ДНҚ-ны қалпына келтіруге мүмкіндік береді, бірақ ерітіндіден алынған хромосомалық ДНҚ емес. Калийдің тағы бір функциясы - натрий додецил сульфатының жауын-шашынын тудырады және осылайша детергентті алып тастайды. Соңғы Центрифугалау жүзеге асырылады және бұл жолы шөгіндіде тек қоқыс бар және оны тастауға болады. Плазмиді бар Супернатант Мұқият алынып тасталады және оны одан әрі тазартуға немесе гель электрофорезі сияқты талдау үшін қолдануға болады .

1. Бактериялық плазмидаларға жалпы түсініктеме.

Бактериялардағы плазмидтер-бұл сақиналы, сирек сызықты, өздігінен көбейетін ДНҚ молекулалары (репликондар), оларсыз жасуша өмір сүре алады (хромосомалардан айырмашылығы, оларсыз жасуша өмір сүре алмайды). Кейде белгілі бір өмір сүру жағдайында плазмидтік функциялар бактериялық популяция үшін өте маңызды болады. Бактериялардың плазмидтері – 10^6-дан 10^8 Д-ге дейінгі ДНҚ молекулалары, олар 40-тан 50-ге дейін ген алады. Бактериалды жасушадағы плазмидтердің саны 1-ден 200-ге дейін болуы мүмкін. Жеке жабық ДНҚ молекуласы (эписома) және хромосома бактериялары (біріктірілген плазмидтер) түрінде болатын плазмидтер бөлінеді. Плазмидтер реттеуші және кодтау функцияларын орындайды. Біріншісі метаболикалық ақауларды өтеуге бағытталған, екіншісі бактерияға жаңа белгілер туралы ақпарат енгізеді. Генетикалық материалдың құрамдас бөлігі ретінде плазмид бактериялары экзотоксиндер, ферменттер немесе бактериоциндер шығару қабілеті, дәрі-дәрмектерге төзімділік және т. б. сияқты сипаттамаларды анықтай отырып, оның өмірінде маңызды рөл атқарады.

Кейбір плазмидтердің ДНҚ-ның екі еселенуі бактериялардың бөлінуін тудырады, яғни олардың "құнарлылығын" арттырады.

Плазмидтердің бірнеше жіктелуі бар.

  Тасымалдау қабілеті бойынша.

Трансмиссивті (конъюгативті) плазмидтер — конъюгация кезінде басқа бактериялық жасушаларға ауысуға қабілетті, құрамында tra (Трансфер) гендері бар.

Трансмиссивті емес (конъюгативті емес) плазмидтер-басқа бактериялық жасушаларға тасымалдауға қабілетсіз, құрамында tra гендері жоқ. Алайда, олардың конъюгациялық берілуі" таза " тасымалдау факторларымен немесе сол бактериялық жасушада орналасқан конъюгативті коинтегративті плазмидтермен қамтамасыз етіледі.