Методы сохранения генофонда

Несмотря на постоянное углубление наших знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, мы все еще далеки от понимания полной картины о процессах, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние. Сопоставляя количество вновь открываемых или создаваемых рекомбинантных микроорганизмов с весьма немногочисленными приемами их хранения, основанными на общебиологических представлениях о строении и физиологии микробных клеток, становится понятным явное отставание знаний в области конкретных подходов.

Механизмы этих процессов в отдельных более хорошо изученных случаях столь эффективны, что обеспечивают сохранение микроорганизмами жизнеспособности и генетической стабильности в течение весьма длительных сроков. В целом практика консервации, развивавшаяся на протяжении многих десятилетий, эмпирически выработала ряд приемов, в различной степени соответствующих тем механизмам погружения клеток в анабиотическое состояние, которые были выявлены (и продолжают выявляться) при изучении образования, свойств и прорастания специализированных покоящихся клеток микроорганизмов.

По современным сведениям, более 99 % микроорганизмов, обитающих в окружающей среде, плохо культивируются в искусственных условиях. Это так называемые некультивируемые микроорганизмы, исследование которых сопряжено с необходимостью их сохранения, что предполагает соответствующие работы по выбору условий консервации-реактивации.

Методы непродолжительного хранения являются одними из самых простых, не требующих дорогостоящего оборудования и в то же время незаменимых в повседневной работе с микроорганизмами.

Субкультивирование, или метод перевиваемых культур. Субкультивирование, или периодический пересев на свежие агаризованные среды, относится к старейшим и давно уже ставшим традиционными методам поддержания и сохранения бактериальных культур как в лабораторных, так и промышленных условиях. Интервал между пересевами зависит от микроорганизма, используемой среды, температурных условий хранения. Метод периодических пересевов прост в исполнении и используется для многих микроорганизмов. Он общедоступен и позволяет легко контролировать чистоту штаммов. Недостатками же метода являются необходимость соблюдения регламентов пересевов, потребность в большом количестве посуды, питательных сред, значительные затраты времени, риск загрязнения культуры, ошибки при обозначении штаммов или наклеивании неправильной этикетки, случаи селекции, риски потерь культур и т.д. Известны случаи изменения биологических свойств микробных культур и даже их гибель.

Хранение под минеральным маслом. С помощью этого сравнительно простого и дешевого метода удается весьма успешно сохранять месяцами или даже годами многие виды бактерий. Впервые его применил A. Limier в 1914 г. для поддержания возбудителя гонореи. Для этого метода обычно используют стерильное минеральное масло медицинского назначения (например, вазелиновое масло). Масло стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 170 °С в течение 1-2 ч. В пробирки с выросшими микроорганизмами стерильно наливают слой минерального масла высотой не менее 2 см. Слой масла служит защитой культур от высыхания, одновременно понижая их метаболизм. Покрытые маслом культуры хранят в вертикальном положении в холодильнике. Для проверки сохранности культур периодически определяют их жизнеспособность. Обычно культуры пересевают 1-2 раза в год на свежую среду.

Хранение в воде и водно-солевых растворах. Клетки с плотностью не более 109 КОЕ/мл вносят в пробирку с индифферентной жидкостью с физиологическим ионным составом и подходящим рН. Например, оптимальный pH для месячного сохранения E. Coli - 8 ед. Пробирки с инокулятом хранят в холодильнике при температуре 4-8 °C.

Недостатки метода. Велика вероятность загрязнения штаммов вследствие благоприятных условий (влажность и температура) для роста грибной флоры во внутреннем объеме пробирки.

Хранение высушиванием на твердых носителях. Большинство бактериальных культур гибнет при высыхании в лабораторных условиях. Однако некоторые культуры, особенно спорообразующие, если были высушены в подходящих для них носителях, сорбирующих влагу, сохраняются годами.