Генетический метод нозерн-гибридизация

Введение

Нозерн-гибридизация применяется для изучения экспрессии генов на уровне тотального содержания РНК в целых растениях, их органах, тканях или группах клеток на разных стадиях развития, а также под действием разнообразных внешних и внутренних факторов. Данный метод был разработан в 1997г. Модификации этого метода позволяют оценивать относительное количество мРНК, рРНК, тРНК, микро-РНК и выявлять отдельные формы созревания или деградации РНК.

Принцип метода

Для проведения нозерн-гибридизации необходимо выделение РНК и ее электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях с последующим перенесением из геля на специальную мембрану (нейлоновую или нитроцеллюлозную), к которой РНК ковалентно «пришивается». Полученные мембраны гибридизируются с меченными ген-специфичными ДНК или РНК пробами для выявления размера и количества интересующих РНК. Стоит отметить, что на каждом из вышеперечисленных этапов возможно применение различных подходов. Так выделение РНК можно выполнять классическим методом с применением фенол-хлороформа, TRIzol реагента с последующим осаждением РНК спиртом из водной фазы или с очисткой РНК через колонки; также иногда применяется очистка РНК с помощью хроматографии на олиго-дТ-целлюлозе. Электрофоретическое разделение РНК обычно проводят в 0,8-1,2% агарозном геле, содержащем формальдегид как денатурирующий агент. Для получения хорошего разрешения при исследованиях низкомолекулярных РНК применяют разделение РНК в полиакриламидном геле, содержащем другой денатурирующий агент — мочевину. Слайд с печью «Пришивание» РНК к мембране возможно при помощи УФ - облучения или нагревания. Наконец, в качестве проб можно использовать одно- или двухцепочечные фрагменты ДНК, а также РНК. Мечение проб можно осуществлять включением радиоактивно- или флуоресцентно-меченных молекул в процессе ПЦР, in vitro транскрипции или в ходе киназной реакции. Для детекции полученных сигналов разработаны специальные сканеры, но можно применять и рентгеновскую пленку. Ввиду столь широкого разнообразия возможностей проведения отдельных этапов нозерн-анализа определения относительного количества растительной РНК методом нозерн-блот гибридизации, успешно применяемым для детекции ядерных и хлоропластных транскриптов размером от 70 до 5000 нуклеотидов.

Перенос РНК с геля на мембрану

Наиболее эффективно перенос РНК с геля осуществляется на нейлоновую положительно заряженную мембрану (Hybond N+) методом капиллярного переноса в 10х SSC.

[pic 1][pic 2][pic 3]

системы переноса необходимо прикатывать пробиркой или другим подходящим предметом, чтобы удалить пузырьки воздуха. Мембрану после переноса высушивают, проверяют качество переноса в УФ свете. «Пришивание» РНК к мембране производится при освещении мембраны УФ светом (длине волны 254 нм) в течение 2 мин. Готовую высушенную мембрану можно хранить при комнатной температуре, обернутой в пластиковую пленку.

Нозерн-гибридизация

Для проведения нозерн-гнбридизации необходимы мембрана с перенесенной на нее РНК и ген-специфичная проба. Мембрану предгибридизуют в течение 1 ч в чистом гибридизационном буфере (ГБ) при температуре 65С и затем заменяют ГБ на свежую порцию, в которой будет проводиться гибридизация. Для гибридизации используют специальные печи с вращающимся ротором, к которому крепятся специальные пробирки для гибридизации. В пробирках на 100 мл гибридизация обычно ведется в 10 мл ГБ. Перед добавлением пробы мембрана и пробирка со свежим ГБ должны быть нагреты до температуры, при которой будет проводиться гибридизация. Подготовка пробы заключается в том, что ее объем доводят до 100-150 мкл ГБ и затем денатурируют в течение 5 мин при 95 °С в случае ДНК или при 75 °С в случае РНК. Денатурированную пробу немедленно помещают в ГБ, находящийся в пробирке для гибридизации, не задевая мембрану. Готовую пробирку с мембраной и пробой устанавливают в ротор гибрндизационной печи, и ведут гибридизацию при постоянном вращении ротора в течение 4 16 ч (чаще всего в течение ночи) при заранее подобранной температуре (обычно 60-65 °С). В случае гетерологичной гибридизации температура гибридизации может быть значительно снижена.