Значение использования живых тест систем в вирусологии

Значение использования живых тест систем в вирусологии.

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний рыб руководствуются следующим нормативным документом: «Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб.

Департамент ветеринарии 10.10.97 г. № 13-4-2/1054 Минсельхозпрод. С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу "Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностикевирусных болезней рыб", утвержденные ГУБ Госагропрома СССР 14.05.87 г. .№ 432-5 Методические указания разработаны во Всероссийском научно-исследовательском институте пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ)».

Целью лабораторного исследования является идентификация выделенного из патологического материала вируса.

Для заражения готовят суспензию из тканей и органов исследуемых рыб, из заражённых культур клеток имеющей признаки ярко выраженного цитопатического эффекта (поражение 75-100% монослоя). Для экстракции вируса собранные пробы (пулы) органов и тканей тщательно растирают пестиком в ступке с кварцевым песком и готовят суспензию 1:10 в свежей порции раствора Хенкса, Эрла или любой из вышеупомянутых питательных сред для культур клеток. Для освобождения от бактерий (деконтаминации) в суспензию добавляют раствор пенициллина и стрептомицина до концентрации 300 ЕД/мл (мет/мл соответственно) и центрифугируют в течение 10 мин при 2000g. Центрифугирование в таком режиме приводит к осаждению бактерий, грибов и их спор. Верхнюю часть супернатанта осторожно отсасывают и используют для инокуляции культур клеток. Для определения контагиозности выявленного заболевания (предположительно вирусной природы) допускается заражение рыб непосредственно суспензией пат материала от больных рыб. Для установления этиологической роли вируса в заболевании в биопробу берут рыб того же вида и возраста, от которого он был изолирован. В биопробе с вирусом, выделенным от вирусоносителей, при необходимости используют также рыб других видов. Объём заражающей дозы вируссодержащего материала и способ заражения подбирают для каждого вида вируса. Вирус должен иметь мин число пассажей in vitro. К заражению восприимчивы рыбы в возрасте от личинки до двухлетков, реже рыбы более старшего возраста и производители. Контрольным рыбам вводят такое же количество растворителя или культуральной жидкости, не зараженной вирусом культуры клеток. Выбор метода заражения зависит от размеров (возраста) рыб. Заражение проводят: внутрибрюшинно или внутримышечно, орошением жабр или выдерживанием рыб в воде содержащей вирус (метод ванн). Для заражения и контроля берут по 10 рыб. Контрольной группе вводят физиологический раствор.

3.1. Метод внутрибрюшинной инъекции (в/б). В/б введение вируса обычно вызывает более высокую гибель рыб, чем заражение методом ванн. Для в/б введения разводят вирус питательной средой, раствором Хенкса или Эрла в 10 раз и вводят шприцем в области ямки позади брюшного плавника у его основания, удерживая рыбу брюшком кверху. Доза введения - от 0,05 мл (для рыб меньше 1 г) до 1 мл (для рыб мас 30-50 г).

3.2. Метод ванн. Для заражения методом ванн рыбу помещают в емкость с водой (отношение массы рыбы к массе воды около 1:10), куда затем добавляют вируссодержащую культуральную жидкость в количестве 1/100 от объема воды (конечная концентрация вируса в воде 103-106 ТЦД50/мл). Заражение ведут в течение 3 часов, аэрируя воду микрокомпрессором и поддерживая температуру на уровне 5-10 оС, после чего высаживают рыбу в аквариум. Контрольную