Качественное изучение влияния соединений на амилазу

[pic 1]

Инженерная школа новых производственных технологий

Кафедра биологии и органической химии

Направление, специальность: биотехнология

Отчет по лабораторной работе

Студент

Руководитель

Томск 2019 г.

Цель работы: исследовать зависимость скорости ингибирования от концентрации исследуемого раствора.

Амилаза – фермент, расщепляющий крахмал до мальтозы (глюкозы) и декстранов (низкомолекулярных полисахаридов). Активатором ферментативной реакции является хлорид ион. Ингибиторами могут быть соли тяжелых металлов (меди, ртути, свинца), жирные кислоты и др. соединения. Ингибиторы амилазы предлагается использовать как противодиабетические препараты, уменьшающие концентрацию глюкозы в крови.

Рисунок 1. Human pancreatic alpha-amylase

[pic 2]

Первичная аминокислотная последовательность:

MKLFWLLFTIGFCWAQYSSNTQQGRTSIVHLFEWRWVDIALECERYLAPKGFGGVQVSPPNENVAIHNPFRPWWERYQPVSYKLCTRSGNEDEFRNMVTRCNNVGVRIYVDAVINHMCGNAVSAGTSSTCGSYFNPGSRDFPAVPYSGWDFNDGKCKTGSGDIENYNDATQVRDCRLSGэжLLDLALGKDYVRSKIAEYMNHLIDIGVAGFRIDASKHMWPGDIKAILDKLHNLNSNWFPEGSKPFIYQEVIDLGGEPIKSSDYFGNGRVTEFKYGAKLGTVIRKWNGEKMSYLKNWGEGWGFMPSDRALVFVDNHDNQRGHGAGGASILTFWDARLYKMAVGFMLAHPYGFTRVMSSYRWPRYFENGKDVNDWVGPPNDNGVTKEVTINPDTTCGNDWVCEHRWRQIRNMVNFRNVVDGQPFTNWYDNGSNQVAFGRGNRGFIVFNNDDWTFSLTLQTGLPAGTYCDVISGDKINGNCTGIKIYVSDDGKAHFSISNSAEDPFIAIHAESKL

Аминокислота (глутаминовая кислота), входящая в активный центр фермента, имеет следующую структуру:

[pic 3]

Существует несколько ингибиторов анализируемого соединения (α-амилазы).

Рисунок 2. Структура соединения и данные результатов его тестирования

[pic 4]

[pic 5]

Однако, наиболее актуальным ингибитором α-амилазы является акарбоза, сложный олигосахарид, который задерживает усвоение усваиваемых углеводов, что приводит к меньшему повышению концентрации глюкозы в крови после еды. Данное соединение и спользуется для снижения уровня глюкозы в крови у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Акарбоза связывается и ингибирует альфа-амилазу и альфа-глюкозидгидролазы. У пациентов с диабетом это ингибирование фермента приводит к задержке абсорбции глюкозы и снижению постпрандиальной гипергликемии.

Рисунок 4. Структура акарбозы (2D- и 3D- модели)

[pic 6]

[pic 7]

Для экспериментального определения влияния соединений на активность ферментов необходимо первоначально определить условия для оптимальной работы фермента. Для поддержания нужного значения рН используют буферные растворы, причем ионная сила раствора («молярность» буфера) также должна быть чересчур большой (0.1-0.01М).

        Вторым этапом работы является нахождение оптимальной концентрации фермента и субстрата, чтобы скорость взаимодействия была приемлемой с точки зрения экономии времени.

        Контроль за ходом взаимодействия фермента и субстрата можно проводить двумя способами, а именно по убыли субстрата и по увеличению концентрации продукта реакции. Выбор того или иного способа определяется аналитическими возможностями. Крахмал образует с иодом комплексы синего цвета, поэтому удобно использовать молекулярный йод и следить за убылью субстрата, т.е. крахмала.

Для оптимизации скорости ферментативной реакции при взаимодействии амилазы и крахмала используют его 0.5 % водный раствор, содержащий 1% хлорида натрия. Количество фермента подбирают опытным путем.