Очистка витамина B12

B12 имеет самую сложную по сравнению с другими витаминами химическую структуру, основой которой является корриновоекольцо. Коррин во многом похож на порфирины (сложные химические структуры, входящие в состав гема, хлорофилла и цитохромов), но отличается от порфиринов тем, что два пятичленных гетероцикла в составе коррина соединены между собой непосредственно, а не метиленовым мостиком. В центре корриновой структуры располагается ион кобальта, образующий четыре координационные связи с атомами азота. Ещё одна координационная связь соединяет кобальт с диметилбензимидазольным нуклеотидом. Последняя, шестая координационная связь кобальта остаётся свободной: именно по этой связи и присоединяется цианогруппа, гидроксильнаягруппа, метильный или 5'-дезоксиаденозильный остаток с образованием четырёх вариантов витамина B12, соответственно. Ковалентная связь углерод-кобальт в структуре цианокобаламина — единственный известный в живой природе пример ковалентной связи переходный металл-углерод.

Метода 1.

Витамина В12 сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витаминной водой, подкисленной до pH 4,5-5 при 85-90 ̊С в течение 60 минут с добавлением в качестве стабилизатора 0,25% NaNO2. При получении Ко-В12 стабилизатор не добавляют.

Водный раствор витамина В12 охлаждают, доводят до pH 6,8-7,0 50% раствором NaOH. К раствору добавляют Al2(SO4)3·18H2O и безводный FeCl3 для коагуляции белков и фильтруют чрез фильтр-пресс.  

Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1,с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Аl2О3, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 - 48 ч. при 3 - 4°С. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Для предотвращения разложения В12 все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

Метода 2. Химическая очистка

Для химической очистки витамина B12 используется его способность образовывать продукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделение витамина B12от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина B12с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат.

Метода 3. Из Ацетоно-бутиловой барды

Ацетоново-бутиловую барду получают путем удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobulylicum, сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0 -2,5% сухих веществ.  К декантированной барде добавляют 4 г/м3 CoCl2 и 0,5% ментола как стимуляторы синтеза комбалина. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN=В12 и фактор III, обладающей биологической активностью, составляющей 80% от суммы всех корриноидов.