Методы изучения генетики

Методы изучения генетики человека и диагностики наследственных болезней

Название метода

Сущность

Разновидности метода

Этапы постановки метода

На каком уровне возможна диагностика

Возможности и преимущества метода

Ограничения и недостатки метода

Примеры заболеваний

Нелабораторные метода

Клинико-генеалогический

Близнецовый

 основан на изучении фенотипа и генотипа близнецов для определения степени влияния среды на развитие различных признаков.

 1. Классический вариант. Выраженность исследуемого признака сопоставляется в парах монозиготных и дизиготных близнецов и оценивается уровень внутрипарного сходства партнеров

2. Метод контрольного близнеца - используется на выборках МЗ близнецов. В эксперименте принимают участие генетически идентичные люди, поэтому можно считать такой способ сравнения моделью для изучения воздействия разных факторов среды на одного и того же человека.

3. Лонгитюдное близнецовое исследование. Проводится длительное наблюдение - прослеживание одних и тех же близнецовых пар.

4. Метод близнецовых семей. При этом исследуются члены семей взрослых близнецовых пар.

5. Метод разлученных близнецов. Метод предполагает сравнение внутрипарного сходства близнецов, которые были разлучены в раннем возрасте и никогда не встречались друг с другом.

 1) составление близнецовой выборки;

2) установление моно- или дизиготности;

3) сопоставление пар и групп близнецов по рассматриваемым признакам.

 1. дает возможность судить о наследственной предрасположенности к формированию признака, развивающегося под действием факторов среды.

2. дает возможность определить относительную роль генотипа и среды в детерминации изучаемого признака.

3. позволяет выявить индивидуально-психологические отличия и ключевые детерминанты психологического развития личности.

4. дает возможность надежной диагностики типа зиготности на основании анализа большого числа критериев.

 1. Ограниченная репрезентативная выборка.

2. недостаточная корректность допущения о равенстве средовых влияний для МЗ и ДЗ близнецов.

3. недостатки, связанные с особенностями пре- и постнатального периода развития близнецов

Дерматоглифический

 Дерматоглифические исследования проводят с целью установления зиготности близнецов, в диагностике наследственных заболеваний, в судебной медицине, в криминалистике для идентификации личности.

Дерматоглифика подразделяется на дактилоскопию (изучение рисунка пальцев), пальмоскопию (изучение особенностей узоров ладоней) и плантоскопию (особенности узоров на стопах ног).

Черная типографская краска тонким слоем раскатывается валиком на стекле. Ладонная поверхность кисти прижимается к стеклу, а затем делается отпечаток на белой бумаге. Полученный отпечаток кожного рисунка больного и его родственников оценивается качественно и количественно.

 В диагностике наследственных заболеваний дерматоглифика применяется потому, что физические признаки, каковыми являются особенности кожного рисунка, у большинства больных с наследственной хромосомной патологией имеют своеобразные отличия. Обследуя родителей, можно заподозрить наследственное заболевание у их детей.

 Данные дерматоглифического анализа менее всего показательны при заболеваниях генной природы

 На формирование дерматоглифических узоров могут оказывать влияние некоторые повреждающие факторы на ранних стадиях эмбрионального развития. Так, при внутриутробном действии вируса коревой краснухи у ребенка наблюдаются некоторые отклонения в узорах, сходные с таковыми при болезни Дауна

Лабораторные методы

Классический цитогенетический

 Сегодня цитогенетический метод изучения наследственности используется при диагностировании, составлении хромосомных карт, анализа мутационного процесса и решения прочих важных проблем.

 а) Кариотипирование

б) Определение Х-полового хроматина.

 1. Культивирование клеток крови на питательных средах

2. Стимуляция митотических делений

3. Добавление колхицина для разрушения нитей веретена деления, остановка деления на стадии метафазы

4. Обработка клеток гипотоническим раствором для свободного расположения хромосом

5. Окрашивание

6. Микроскопирование и фотографирование

7. Построение идиограммы

 Геннный

 Рутинный метод окрашивания позволяет относительно легко отнести ту или иную пару гомологичных хромосом к соответствующей группе. При окрашивании для каждой пары хромосом характерен собственный специфический характер чередования поперечных полос, поэтому дифференциальное окрашивание позволяет выявлять как численные, так и структурные аномалии кариотипа, а также идентифицировать каждую хромосому.

 Мало-информативно при идентификации хромосом и изучении структурных перестроек. Ограничение заключается в необходимости нужного оборудования для проведения данного метода. Протекает метод изучения очень долго.

 Наиболее часто встречаются болезнь Дауна, синдром Клайнфелтера, синдром Шершевского — Тернера и др.

Молекулярно - цитогенетический

 Молекулярно-цитогенетические методы включают проведение всех этапов цитогенетического анализа и, кроме того, приготовление меченых ДНК-проб и проведение молекулярной гибридизации (на препарате).

 1) Метод FISH- флуоресцентная гибридизация

2)CGH - метод сравнительной геномной гибридизации

3)Метод CGH

4)SKY - спектроскопический анализ хромосом

 - создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин; зонды могут быть комплементарны хромосоме или ее конкретному участку;

- щелочная обработка препаратов in situ с целью денатурации хромосомной ДНК за счет разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК;

- гибридизация хромосомной ДНК с зондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы;

- обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином (и дигоксегенином; для биотина таким веществом является стрептовидин, для

дигоксегенина - антидигоксигениновое антитело; к этим веществам могут быть присоединены флуоресцентные красители (родамин или флуоресцеинт изотиоцианат);

- визуализация хромосом с помощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.

 1) Геномный; 2) Хромосомный; 3) Генный.

 1. Высокая специфичность.

2. Высокая чувствительность.

3. Возможность осуществлять диагностику инфекций и инвазий, диагностика которых затруднена с использованием микроскопического, бактериологического методов.

4.Возможность использования для экспресс-диагностики.

5. Возможность полной автоматизации и высокая производительность.

6.Низкая вероятность инфицирования персонала в процессе проведения исследований.

 1. Отсутствие международных протоколов по молекулярно-генетической диагностике различных нозологических форм заболеваний.

2. Необходимость разработки новых подходов к клинической интерпретации получаемых результатов.

3. Высокая стоимость оборудования.

 синдром Прадера-Вилли,синдром Ангельмана, синдром Вильямса, синдром аниридии, умственной отсталости и опухоли Вильямса

Молекулярно-генетический

Диагностика

мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями,

а также выявление гетерозиготных и гомозиготных

носителей мутации  

Прямые методы ДНК-диагностики: 1)Рестрикционный анализ; 2)Аллельспецифичная ПЦР;                                      3)Метод анализа

конформационного полиморфизма однонитевой ДНК; 4)Гетеродуплексный анализ; 5)Денатурирующий

градиентный гель-электрофорез.            Косвенные методы ДНК-диагностики  применяют в том случае,

если ген, повреждение в котором приводит к заболеванию, не идентифицирован,

а лишь локализован на определенной хромосоме,

или когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата.

1)Получение образцов ДНК (или РНК); 2)Полимеразная цепная реакция;  3)Рестрикция ДНК на фрагменты; 4)Электрофорез фрагментов ДНК; 5)Визуализация и идентификация фрагментов ДНК; 6)Блот-гибридизации по Саузерну;     7)Метод секвенирования.

1)Геномный; 2)Хромосомный; 3)Генный.

Использование унифицированного набора методов, практически не зависящего от целей проводимого исследования. 1)высокая специфичность и чувствительность;

2)высокая достоверность; 3)универсальность;

4)быстрота и информативность.

1)Очень дорого!!!; 2)Предполагает исследование на определенный патоген, а не на широкий спектр агентов; 3)Отсутствует регистрация многих тест-систем в Росии.

1)Альбинизм; 2)Синдром; Марфана 3)Миотоническая дистрофия; 4)Ахондроплазия; 5)Синдром Элерса-Данло;          6)Синдром Тричера-Коллинза.

Биохимические

используется для диагностики наследственных болезней обмена веществ (НБО)

 1) Хроматографические методы дают информацию о спектре и количестве веществ;

2) Метод высоковольтного электрофореза с последующей нисходящей хроматографией аминокислот на бумаге даёт ту де информацию, но отличается высокой пропускной способностью и менее чувствителен

3) Высокоэффективная жидкостная хроматография(ВЭЖХ) - позволяют получать как количественную , так и качественную информацию

4) Тандемная масс- спектрометрия – метод, с помощью которого можно количественно оценить 300 метаболических маркеров разных групп НБО одновременно и охарактеризовать классы в-в и их Mr.

 Диагностика нарушений обменных процессов биохимическими методами проводится двумя этапами: 1) первичный уровень - проводится отбор предположительных случаев заболевания 2)уточняющий уровень - уточняется диагноз заболевания более точной и сложной методикой.

 генный уровень

 К числу преимуществ биохимического метода относится способность разрушать различные классы органических соединений и возможность применения на многих производствах; метод не требует специального дорогостоящего оборудования, интерпретация результатов довольно проста, а стоимость одного анализа невысока.

 Ограничение заключается в необходимости нужного оборудования для проведения данного метода. Недостатков нет.

 Болезни углеводного обмена, болезни холестеринового обмена, органические ацидурии, лизосомные болезни, пероксисомные болезни, митохондриальные болезни и т.д.

Методы пренатальной диагностики

Неинвазивные

Ультразвуковое исследование

 распознавание патологических изменений органов и тканей организма с помощью ультразвука.

 УЗИ может быть обычным, в режиме реального времени, или доплеровским. Доплеровское УЗИ проводится для исследования сосудов на основе использования эффекта Доплера

А также выделяют 2D,3D, 4D

 генный уровень

 Этот метод позволяет определить развитие плода и оценить его общее состояние, а также диагностика возможных наследственных и врожденных патологий плода. А также способствует выявлению внематочной беременности

 не всегда возможно выявить паталогии пр. мелкие дефекты в перегородках сердца

 диагностирует синдром Дауна

Анализ крови матери на сывороточные факторы

 выявляет группы риска беременных женщин с возможными пороками развития плода

 «тройной тест» : исследование содержания в крови беременной женщины трех веществ : 1.Альфа-фетопротеина (АФП)-вещество ,вырабатывающееся печенью плода,попадаемого через плаценту в кровь матери.2.Хорионичееского гонадотропина (ХГ)-гормона,оплодотворенной яйцеклетки.3.Неконьюгированного эстриола (НЭ) -гормона,отвечающего за нормалтное протекание беременности.

 хромосомный

 эффективность метода : 70% всех случаев синдрома Дауна и дефектов выявлены на сроках 15-22 недели беременности.

 не точен при беременности двойней и более,т.к. уровень исследуемых веществ выше ,что делает прогноз непригодным.

 синдром Дауна, синдром Эдвардса ,дефекты развития нервной трубки ,аномалии почек

Неинвазивное пренатальное тестирование (ДОТ-тест)

Инвазивные

Биопсия хориона

Плацентоцентез

 взятие для анализа клеток плаценты с целью определения их генетической и хромосомной структуры. С помощью данного метода можно диагностировать тяжелейшие генетические заболевания, которые сопровождаются умственными и психическими отклонениями, множеством физических патологий.

 1.подготовительный этап-взятие мазка, анализ крови и мочи, узи при необходимости; 2.выполнение-провдят под местной анастезией,для взятия клеток используют пункционную иглу для прокола брюшной полости. 3. Забор клеток для анализа

 генный и хромосомный

 дородовой анализ, точный, крайне редко бывают осложнения 

 самопроизвольное прерывание беременности, отслойка плаценты и все возможные её осложнения, внутриматочная инфекция, на большом сроке этот метод не используется 

 синдром Дауна, Патау, Эдвардса, гемофилию, муковисцидоз

Амниоцентез

 Главной сутью амниоцентеза является проведение пункции амниотического (околоплодного) пузыря, в котором находиться развивающийся плод.

 По времени проведения исследования, амниоцентез бывает:

* Ранним;

* Поздним.

В зависимости от технических особенностей проведения амниоцентеза, выделяют два способа процедуры:

1. «Свободной руки» — когда врач непосредственно рукой вводит пункционную иглу;

2. С помощью пункционного адаптера — дополнительное устройство помогает сделать движения руки специалиста более точными и бережными, снижая риск повреждения плаценты и плодных тканей.

 Во время проведения амниоцентеза беременную укладывают на спину. Затем при помощи процедуры УЗИ врач определяет место, куда можно ввести иглу, не зацепив плод. На следующем этапе в указанное место вводится длинная тонкая игла. При помощи иглы берется проба амниотической жидкости объёмом 10-15 мл (не больше столовой ложки). После ее извлечения место прокола обрабатывают антисептиком.

 Хромосомный

 диагностика различных болезней и состояний плода;

* удаление избытка околоплодных вод при многоводии;

* необходимость введения специальных средств с целью прерывания беременности;

* внутриутробное лечение плода, в том числе хирургическое.

 угроза прерывания беременности.

* преждевременное излитие околоплодных вод (при трансвагинальном доступе);

* подтекание околоплодных вод в течение первого дня после вмешательства;

* повреждение сосудов плода;

* травма кишечника или мочевого пузыря матери;

* хориоамнионит;

* разрыв плодных оболочек; * отслойка плаценты;

* преждевременные роды.

 Синдром Дауна; Синдром Эвардса; Синдром Патау; Синдром Тернера; Синдром Клайнфельтера

Кордоцентез

 Этапы выполнения процедуры кордоцентез:

* Обработка места на передней брюшной стенке женщины, куда будут вводить пункционную иглу.

* Прокалывание пункционной тонкой иглой передней брюшной стенки беременной женщины

* Введение иглы в пупочную вену в том месте, где она прикрепляется к плаценте.

- [ ] Непосредственно забор пуповинной крови в количестве около 1 мл

 Генный, хромосомный

 Кордоцентез при беременности позволяет, кроме диагностических анализов, провести лечение плода внутриутробное 

 Синдром Дауна, *Синдром Кляйнфельтера и Шерешевского-Тернера и пр. (изменение числа половых хромосом);
* Муковисцидоз;
* Болезнь Дюшена;
* Талассемия, гемофилия и другие генетические болезни плода;
*

Биопсия тканей плода

 получение образца ткани хориона с целью выявления наследственных заболеваний

  хорионбиопсия (биопсия ворсин хориона);
* плацентцентез;
* амниоцентез;
* кордоцентез;
* биопсия тканей плода.

 Фенотипический 

 определение наличия наследственного заболевания у плода (хориона) 

пороки развития матки, поздний срок (12-30 неделя беременности), ложноположительные результаты,Существует также риск выкидыша, риск кровотечения у женщины, риск инфицирования плода

 синдром Дауна, Дюшена, Эдвардса, Патау и различные генные мутации