Аналіз впливу умов культивування на рівень синтезу амінокислоти лізин продуцентом Brevibacterium flavum

Обраний продуцент: Brevibacterium flavum

Цільовий продукт біосинтезу: амінокислота лізин

Лізин  - аліфатична амінокислота з вираженими властивостями основи. Як і інші аліфатичні амінокислоти, лізин в організмі людини не синтезується і є незамінною а/к.[pic 1]

Хімічна формула:

 Амінокислоти (окрім гліцину) мають асиметричний вуглецевий атом і існують в двох дзеркальних ізомерних формах, званих енантіомерами, L- і D-конфігурації. Енантіомери володіють однаковими хімічними властивостями. Їх хімічний синтез завершується зазвичай здобуттям D,L-ізомерів, які досить складний розділити на індивідуальні ізомери хімічною дорогою, що необхідне для подальшого використання амінокислот, оскільки всі молекули білків організму складаються з L- ізомерів. Тому доцільніше використовувати при виробництві амінокислот біологічний синтез, при якому використовувані мікроорганізми утворюють амінокислоти в біологічно активній L-формі.[11]

В даний час більш всього розробки присвячені добуванню лізину продуцентами Brevibacterium lactofermentum і бактерії роду Corynebacterium.

1. Штам Brevibacterium flavum 11635

Мутант виду Brevibacterium flavum, стійкий до фузидинової кислоти і володіє підвищеною продуктивністю по L-лізину.

Культурально-морфологічні ознаки:

• клітини овальні, розміром 1,0-1,5 × 0,6-0,6-0,8 мкм, нерухомі, грампозитивні, спор не утворюють;
• через 2-4 доби зростання при 30 ° C на МПА (ГОСТ 29112-91) утворює колонії діаметром 2-4 мм, жовтувато-кремові, поверхня гладка, форма опукла, край рівний, структура однорідна тістоподібна;
• при посіві штрихом через 2-4 доби зростання помірний, край гладкий, поверхня матова.

Фізіолого-біохімічні ознаки:

• аероб;
• добре росте на глюкозі, сахарози, мальтози, фруктози, манозі, етанолі, оцтової кислоти, не росте на ксилозі, арабінозі, лактозі, раффинозі;
• засвоює азот у формі солей амонію і сечовини;
• зростає при температурі 24-37 ° C, оптимальна температура 30-32 ° C;
• зростає на середовищах з pH від 6 до 8,5, оптимальне значення pH 6,8-7,2;
• при зростанні в мінімальному середовищі потребує біотин, тіамін та L-лейцин;
• стійкий до аналогу лізину S- (2-аміноетил) -L-цистеїну (АЕЦ);
• стійкий до фузидинову кислоті.[10]

2. Умови ефективного біосинтезу лізину

Процес синтезу амінокислот (лізину, треоніну, метіоніну, ізолейцину) починається фосфорилуванням аспарагінової кислоти за участю аллостеріческого ферменту аспартаткінази, активність якого відзначено зниження спільною дією двох амінокислот - лізину і треоніну, якщо вони накопичуються в клітинах бактерій в надлишкової концентрації. Якщо знизити концентрацію однієї з цих амінокислот, то синтез інший здійснюватиметься навіть за умови, коли вона накопичується в досить високій концентрації.[5]

Для зняття регуляції синтезу лізину необхідно припинити утворення треоніну на стадії перетворення напівальдегід аспарагінової кислоти в гомосерін, що каталізує ферментом гомосеріндегідрогеназой, що досягається за допомогою мутагенезу. Досліди показують, що мутантні клітини, що не утворюють гомосеріндегідрогенази, при їх культивуванні на штучному живильному середовищі забезпечують високий вихід лізину. Дефіцитні амінокислоти, які не синтезуються мутантними клітинами (гомосерін, треонін, метіонін), вводяться до складу живильного середовища в такій кількості, щоб вони не були регуляторами синтезу лізину.

Інтенсифікацію біосинтезу досягають як за рахунок безпосереднього впливу на штами-продуценти, створення штамів з підвищеною продуктивністю, так і шляхом розширення спектру субстратів, що використовуються, оптимізацією умов культивування, вдосконаленням масообмінних процесів та технологічного обладнання[6]

1. Склад середовища

У процесі приготування живильного середовища для культивування виробничих штамів ауксотрофності мутантів, що володіють здатністю до сверхсинтезу амінокислоти лізину, в якості джерела вуглецю використовують зазвичай суміші, що включають оцтову кислоту і бурякову мелясу, як джерело азоту - солі амонію, сечовину. Крім дефіцитних амінокислот, які не синтезуються клітинами мутантів, в живильне середовище також додають необхідні для життєдіяльності мікроорганізмів мікро- і макроелементи, вітаміни (біотин, вітамін В і ін.). У процесі культивування мікроорганізмів забезпечується подача стерильного повітря за допомогою спеціальних турбінних мішалок, а для запобігання спінювання субстрату і клітинної суспензії в середу культивування додають піногасники.[6]