Культура одиночных клеток

Практическая работа 7.  Культура одиночных клеток

Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость клонового материала. Одиночные клетки используются в клеточной селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же время – это хорошая модель для изучения онтогенеза и физиологии клетки. Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде; мацерированные ткани растений (мезофилл листа); изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки. Наиболее эффективными методами для получения культуры одиночных клеток являются: метод «кормящего слоя», «культуры-няньки», кондиционированных сред, микрокапель. Для получения генетически стабильных клонов и клеточной селекции используется метод Плейтинга.

Работа 7.1. Получение клеточных клонов на агаризованных средах методом Плейтинга

Цель работы: освоить получение клеточных клонов методом Плейтинга.

Материалы и оборудование: колбы с суспензией, стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, чашки Петри с агаризованной средой для каллюсогенеза (1,2 – 1,4 % агара), инструменты: пинцеты, препаровальные иглы, спиртовка, 96 % спирт.

Ход работы:

1. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток).
2. Смешать фракцию суспензии с 5 мл агаризированной (1,4 % агара) среды.
3. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре или стакане в стерильных условиях.
4. Полученную смесь разлить в чашки Петри слоем до 1 см.
5. Чашки        Петри        закрыть        крышками        и        герметизировать пара- филмом.
6. Культивировать в термостате при 25–26 оС.
7. Количество колоний подсчитать через 4–6 недель.
8. Результаты зарисовать, подсчитать плотность высева по формуле:

Эффективность высева =[pic 1]

количество образовавшихся колоний количество высеянных клеток

× 100 %

ТЕМА 7.1 Культура изолированных протопластов высших растений

Изолированный протопласт – живое содержимое клетки, лишенное клеточной оболочки, но сохраняющее все физиологические и био- химические характеристики клетки.

Изолированные протопласты  можно получить механическим и ферментативным (энзиматическим) способом.

Среда для получения и культивирования изолированных прото- пластов обязательно должна содержать осмотические стабилизаторы – маннит, сорбит, сахарозу, глюкозу и др.

Изолированные протопласты можно выделить из различных тканей и органов интактного растения (чаще используют хлоренхиму листьев) или каллюсной и суспензионной культуры.

При энзиматическом (более распространенном способе получения протопластов) используют ферментативные препараты, содержащие смесь пектиназ, гемицеллюлаз и целлюлаз – комплекс ферментов, разрушающих клеточную оболочку растительной клетки.

После удаления раствора ферментов начинается спонтанное обра- зование (регенерация) клеточной стенки, после чего образовавшиеся клетки начинают делиться, образуя микроколонии, состоящие из 20-40 клеток. Затем из микроколоний образуются хорошо развитые проли- ферирующие каллюсные ткани, из которых можно получить растение- регенерант, что свидетельствует о топипотентности протопластов.

Интактное растение (растение-донор)

[pic 2]

Каллюсная культура[pic 3][pic 4][pic 5][pic 6]

Культура        Культура        Суспензионная одиночных [pic 7] изолированных [pic 8] культура