Быстрое и не содержащее гормонов Agrobacterium rhizogenes

Быстрое и не содержащее гормонов Agrobacterium rhizogenes-опосредованное
превращение производящий одуванчики Taraxacum kok-saghyz
и T. brevicorniculatum

Материалы и методы
2.1. Растительные материалы
Семена ТЗ из присоединения к Министерству сельского хозяйства США KAZ08-017 (W6 35172) и

апомиктической линии туберкулеза, подаренной Питером ван Дейком (Keygene, Wagenin-
gen, Нидерланды), обозначенные как Clone A (Kirschner

et al., 2013). Семена подвергали поверхностной стерилизации с 70% этанолом для

2 мин, затем вымачивают в 0,25% растворе гипохлорита натрия
с 0,5% додецилсульфатом натрия в течение 10 мин. Затем семена были

промывали с помощью автоклавной воды 5 раз и проращивали на твердой половине
прочность Murashige и Skoog (1/2 MS) среда (1/2 прочность MS
микро- и макросолей (Caisson Laboratories, Inc., North Logan,

Штат Юта, США), дополненная полной силой Gamborg's B5 vita-
мин, 10 г L-1курозы и 8 г агара L-1 (Sigma-Aldrich®, St. Louis,

MO, USA)) (Murashige and Skoog, 1962, Gamborg et al., 1968).
Растения поддерживали при 23-27 ° С в течение 16 ч / 8 ч

фотопериод с интенсивностью света 30 моль м-2 с-1,
флуоресцентных ламп и выращивали в течение 12 недель.

2.2. Двоичный вектор и штамм Agrobacterium
Вектор серии pEarleyGate 100 (Arabidopsis Biological
Номер ресурсного центра (ABRC): CD3-724) были изменены
путем замены гена устойчивости к глюфосинату канамицином

резистентный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII) в качестве селекто-
(Earley et al., 2006). Использовали канамицин вместо

glufosinate, поскольку считается более экологически безобидным и
чаще используется для селекции на двудольных растениях (Nap
et al., 1992; Мики и МакХью, 2004). Гены, кодирующие GFP и CFP
амплифицировали с использованием высококачественной полимеразы Platinum® Taq ДНК с высокой точностью
(InvitrogenTM, Carlsbad, CA, USA) из векторов pEarleyGate, полученных из источников
из биологического ресурсного центра Arabidopsis штата Огайо (ABRC
серийный номер CD3-685 и CD3-684 соответственно). Ампликонны тогда
клонировали в модифицированный вектор pEarleyGate 100, используя

PCR8 / GW / TOPO Cloning Kit и LR Clonase (InvitrogenTM, Carls-
bad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя,

как pEG-35S :: GFP (фиг.1A) и pEG-35S :: CFP (фиг.1B). выражение
векторы были введены в дикий тип A. rhizogenes K599 (любезно
предоставленный профессором Джоном Финнером, Университетом штата Огайо, ОАРД,
Wooster, OH, США) электропорацией. A. rhizogenes, укрывательство
экспрессирующих конструкций, выращивали в течение 36 ч в жидкой среде YEP
(10 г дрожжевого экстракта L-1, 10 г пептона L-1, 5 г L-1 NaCl), содержащего

100 мг L-1 канамицина, встряхивают при 150 об / мин при 28 ° С. Agrobac-
культуры терии затем гранулировали и последовательно промывали

жидкая среда YEP и среда 1/2 MS, содержащая 200 M ace-
tosyringone. Культуры Agrobacteria, наконец, суспендировали в жидкости