Современные методы исследования в иммунологии

Выполнил:

Задания к занятию «Современные методы исследования в иммунологии»

1.  Опишите принцип работы проточного цитофлуориметра. Какие характеристики клеток можно определить с помощью метода проточной цитофлуориметрии?

В основе проточной цитофлуориметрии лежит проведение фотометрических и флуоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.

Прибор, на котором проводится анализ, называется проточный цитофлуориметр. Он включает в себя три основных блока: оптический блок, блок обработки сигналов и блок сбора и обработки данных.

Пробирка с суспензией клеток помещается в проточный цитометр, где с помощью специальной иглы под давлением впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока частиц. В проточной ячейке, клетки выстраиваются в тонкую цепочку (принцип гидродинамического фокусирования) и пересекают луч аргонового лазера. При этом молекулы флуоресцентных красителей, связанные с клетками, испускают кванты света определённой длины волны. Это излучение регистрируется высокочувствительными детекторами, преобразующими его в сигналы, поддающиеся компьютерной обработке.

Цитометрический анализ проводится по нескольким параметрам:

- характеристики светорассеяния: FSC (forward side scatter) – показатель прямого светорассеяния и SSC (side scatter) – показатель бокового светорассеяния;

- характеристики флюоресценции - FL .

На их основе программой строятся точечные гистограммы распределения клеток по их характеристикам (светорассеянию и флюоресценции). Анализ полученных гистограмм позволяет охарактеризовать исследуемые клетки.

1. Вам даны моноклональные антитела к CD3, CD4, CD8, CD45. Перечислите, какие фенотипы клеток с их помощью можно определить. Какие популяции лимфоцитов им соответствуют.

Т-хелперы/индукторы (CD3+CD4+CD45+)

Т-цитотоксические лимфоциты (Т-ЦТЛ) (CD3+CD8+CD45+)

Т-лимфоциты, экспрессирующие маркеры NK-клеток(Т-NK-клетки) (CD3+CD56+CD45+);

NK-клетки, экспрессирующие α-цепь антигена CD8 (CD3-СD8+CD45+)

1.  Опишите иммунотурбидиметрический и нефелометрический методы исследования.

Иммунотурбидиметрия и нефелометрия – это методы количественного высокоточного определения концентрации индивидуальных (специфических) белков по изменению мутности раствора при образовании комплекса антиген-антитело. Образование такого комплекса приводит к повышению мутности раствора, которое измеряется на приборе.

Нефелометрия регистрирует световой поток, который рассеивается под определенным углом иммунными агрегатами, взвешенными в оптически прозрачной среде. Турбидиметрия, напротив, регистрирует свет поглощаемый комплексами антиген-антитело. Интенсивность рассеянного света или разность светового потока прямо пропорциональна величине и числу иммунных комплексов.

Принцип метода. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма крови. Исследование проводится на биохимическом автоматическом анализаторе. Исследуемый белок, содержащийся в пробе, формирует иммунные комплексы с соответствующими антителами. Образуется мутная суспензия, оптическая плотность которой измеряется фотометрически. Величина оптической плотности зависит от содержания измеряемого аналита в пробе.

        Исследуемые белки: факторы гуморального иммунитета: иммуноглобулины А, G, М, СЗ- и С4-компоненты комплемента; белки «острой фазы»: С-реактивный белок, церулоплазмин, гаптоглобин, трансферрин, ревматоидный фактор; другие белки плазмы: альбумин, антистрептолизин О (АСЛО); белки мочи: микроальбумин.