Детекция транслокации кишечной микрофлоры методом выявления бактериальной ДНК в крови с помощью полимеразной цепной реакции при острой к

Аманова Д.Е.

Бабенко Д.Б.

Ивачёв П.А.

Токпанова А.С,

Комаров Т.В.

Огизбаева А.В.

Детекция транслокации кишечной микрофлоры методом выявления бактериальной ДНК в крови с помощью полимеразной цепной реакции при острой кишечной непроходимости

Караганда, 2019

Феномен микробной транслокации при различных видах острой кишечной непроходимости является одним из ключевых моментов, обуславливающих развитие инфекционных осложнений и тяжесть их течения. Традиционные методы детекции данного явления до сегодняшнего дня основаны на выявлении бактериальных изолятов и их колоний (например, микробиологические методы). Эти методы трудоёмки, включают многократные биохимические тесты, являются дорогостоящими и не всегда эффективными, особенно в отношении «привередливых» микроорганизмов. В последние годы широко используются автоматизированные инструменты идентификации бактерий, что привело к большей надёжности и информативности данных методик, но, тем не менее, существуют определенные противоречия в результатах [1–4]. Кроме того, многие исследовательские лаборатории недостаточно оснащены для проведения идентификационных тестов, и часто используют трудоемкую биохимическую характеристику или 16S рРНК последовательность для типирования вида.

Несмотря на значительные достижения молекулярной биологии, молекулярно-генетические методы идентификации видов не получили широкого распространения. Некоторые факторы, такие как аллельная изменчивость в генах-мишенях, перекрестная реакция с другими видами и отсутствие достаточного опыта молекулярных исследований повлияли на ограничение использования данных методов в рутинной практике. Однако, несмотря на эти ограничения, молекулярные методы имеют значительное преимущество по сравнению с методами фенотипирования, и, в первую очередь, это связано с высокой чувствительностью данной методики. Сравнительно недавно описан метод детекции бактериальной 16S рРНК в режиме реального времени. ПЦР-праймер, разработанный с выравниванием 962,279 бактериальных 16S генных последовательностей рРНК, которые будут амплифицировать продукт из 16S гена рРНК в 93,6% всех бактериальных генов 16S рРНК. Сочетание детекции гена 16S рРНК с видоспецифичными праймерами может значительно снизить усилия, необходимые для скрининга больших бактериальных популяций с отрицательными образцами [5].

Нашим авторским коллективом предложен метод: «Детекция транслокации кишечной микрофлоры методом выявления бактериальной ДНК в крови с помощью полимеразной цепной реакции при острой кишечной непроходимости».

В данном исследовании нами проводилась ПЦР в режиме «реального времени» («Real-time PCR»). Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа. При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которых заведомо известно количество копий ДНК (калибровочные образцы). Сравнение динамики накопления продуктов амплификации в экспериментальных и контрольных образцах позволяет оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК. Следует отметить, что для выполнения количественного ПЦР-анализа рекомендуется использование препаратов ДНК с высокой степенью очистки, так как присутствие нежелательных примесей (ингибиторов) снижает эффективность амплификации исследуемой и контрольной ДНК.

Алгоритм метода:

1. Для проведения молекулярно-генетического исследования у лабораторных животных под общим обезболиванием раствором кетамина в дозировке 0,15 мг/г массы тела животного внутримышечно производился забор крови, как указано на рисунке 1. Забор крови и тем самым выведение животных из эксперимента осуществлялось путём обескровливания в соответствии с рекомендациями «AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition» [6].

[pic 1]

Рис. 1. Забор крови пункционным методом из сердца.