Промышленные способы культивирования микроорганизмов

ПРОМЫШЛЕННЫЕ СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Производственное культивирование микроорганизмов является основной стадией технологического процесса, во многом определяющей технико-экономические показатели производства биопрепаратов. В биотехнологической практике находят применение различные методы культивирования микроорганизмов (рис. 1), в основе которых лежит глубинное или поверхностное культивирование. Рис.  1.

Классификация способов и процессов культивирования микроорганизмов

Поверхностный способ культивирования применим только для аэробных микроорганизмов, которые выращивают на поверхности жидкой или твердой (плотной или сыпучей) среды. В промышленных условиях поверхностное культивирование микроорганизмов находит ограниченное применение (например, выращивание мицелиальных грибов в производстве ферментных препаратов, органических кислот (лимонная, итаконовая) по ряду причин: низкий уровень механизации и автоматизации технологического процесса (большие затраты ручного труда); невысокая производительность ферментационного оборудования – растильных камер, занимающих большие производственные площади; не исключается контакт работающих с поверхностной культурой (мицелиальные грибы и их конидии), что недопустимо по санитарно-гигиеническим требованиям; низкая степень использования компонентов питательной среды. Простейшие растильные камеры (рис.  2) имеют стационарные горизонтальные стеллажи или подвижные этажерки, на которых ярусами располагаются прямоугольные открытые кюветы с высотой бортика 30-150 мм, заполненные жидкой или сыпучей (пшеничные отруби) средой. Камеры аэрируются стерильным, кондиционированным по температуре и влажности воздухом, расход которого рассчитывается на отвод выделяющегося биологического тепла. Рис.  2.

Схема растильной камеры: 1 – прозрачная стенка камеры; 2 – стеллажи с кюветами; 3 – шибер; 4 – фильтр; 5 – кондиционер Более совершенны механизированные установки (рис.3), в которых в закрытой камере располагаются растильные блоки размером 1600×1600×1300 мм с вертикальными перфорированными перегородками, образующими 23 вертикальные кюветы шириной 55–70 мм (рис. 4). Просветы между кюветами выполняют роль воздушных каналов. Снизу и сверху кюветы имеют открывающиеся крышки. Кюветы блока одновременно загружаются сыпучей средой на вибрационном столе и по замкнутому рельсовому пути передаются в растильную камеру. Разгрузка кювет также производится на вибрационном столе, после чего блок подвергается мойке и стерилизации паром и рабочий цикл повторяется. Вместимость каждого блока 500 кг по сухим отрубям. Преимущества установки заключаются в механизации процесса выращивания культуры, в возможности локализации и ликвидации очага инфекции, возникшей в процессе культивирования. Рис. 3.

Механизированная установка с вертикальными кюветами: 1 – стерилизатор питательной среды; 2 – вибрационный загрузочный стол; 3 – перегородка, отделяющая стерилизационное отделение от растильного с герметичными дверями; 4 – рельсовый путь; 5 – воздуховоды для отработанного воздуха; 6 – воздуховоды от кондиционеров, подающих воздух в растильные блоки; 7 – подвижные растильные блоки; 8 – растильная камера; 9 – поворотный круг; 10 – разгрузочный вибрационный стол; 11 – приемный бункер для культуры; 12 – камера мойки и стерилизации растильных блоков Рис.  4. Растильный блок Современным требованиям в наибольшей степени отвечают вертикальные колонные аппараты с горизонтальными жалюзийными тарелками, на которых располагается слой сыпучей среды толщиной до 300 мм (рис.  5). Аппарат имеет 8–10 тарелок. Инокулированная сыпучая среда подается на верхнюю тарелку. После выдержки при непрерывном механическом разрыхлении среды на тарелке в течение суток горизонтальные жалюзи тарелки переводятся в вертикальное положение и культура пересыпается на нижележащую тарелку. Процесс повторяется до выхода культуры из аппарата. Противотоком в колонну подается стерильный воздух. Аппарат работает в непрерывном режиме. Рис. 4.5. Аппарат для поверхностного культивирования грибов в слое сыпучей среды: 1 – жалюзийная тарелка; 2 – гребок; 3 – охлаждающие змеевики; 4 – водяная рубашка При глубинном (суспензионном) культивировании микробные клетки растут во всем объеме жидкой питательной среды, в которой они суспендированы и находятся во взвешенном состоянии. Глубинный метод пригоден для выращивания как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов. Подавляющее большинство производственных продуцентов – аэробные культуры, требующие интенсивной принудительной аэрации среды. Глубинный способ культивирования имеет ряд очевидных преимуществ перед поверхностным: – позволяет исключить тяжелый непроизводительный ручной труд и значительно сократить производственные площади; – обеспечивает высокий уровень стерильности процесса; – улучшает гигиену труда; – упрощает автоматизацию производства; – дает возможность осуществлять непрерывный процесс ферментации; – обеспечивает более полное использование питательных веществ среды. Глубинный метод культивирования микроорганизмов требует более высокой культуры производства, однако указанные выше достоинства метода обусловили его широкое распространение. В производственной практике глубинное культивирование микроорганизмов осуществляют в периодическом или непрерывном режиме. Принцип периодического метода культивирования состоит в том, что в аппарат в процессе культивирования не вносятся дополнительные питательные компоненты и не выводится из него среда с биомассой и продуктами метаболизма. В этом случае рост популяции протекает по S-образной кривой, на которой различают шесть стадий (фаз) роста (рис. 4.6). Развитие культуры начинается с лаг-фазы. В этот период плотность популяции не возрастает (в некоторых случаях наблюдается снижение концентрации). Клетки посевного материала переходят из состояния голодания в состояние, соответствующее способности к размножению. Размер клеток увеличивается, активно протекают биохимические процессы, связанные с подготовкой к размножению. Длительность лаг-фазы зависит от: – доброкачественности питательной среды; – свойств и физиологической активности культуры; – количества посевного материала и других факторов. Рис. 4.6. Рост популяции в периодической культуре: 1 – лаг-фаза(начальная); 2 – фаза ускорения роста; 3 – экспоненциальная фаза; 4 – фаза замедления роста; 5 – стационарная фаза; 6 – фаза отмирания Фаза ускорения роста характеризуется началом деления клеток и увеличением удельной скорости роста популяции до максимальной. Обычно эта фаза непродолжительна. Лог-фаза – фаза наиболее активного роста клеток. Удельная скорость роста является максимальной и в большинстве случаев постоянной. Логарифм числа клеток линейно зависит от времени. Развитие популяции в этой фазе не лимитируется питательными веществами и не тормозится продуктами жизнедеятельности. Эта фаза не может быть длительной. Со временем популяция начинает испытывать недостаток в одном или нескольких элементах питания. Среда истощается, в ней накапливаются продукты обмена веществ, ингибирующие рост микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, клетки мешают друг другу, уменьшается поверхность их контакта со средой, ухудшается поступление питательных веществ в клетку и выброс продуктов метаболизма. Скорость роста понижается, наступает фаза замедления скорости роста. По мере потребления питательных веществ концентрация биомассы продолжает расти, но медленнее, удельная скорость роста популяции снижается. Популяция переходит в стационарную фазу развития, в которой скорость роста снижается до нуля. Концентрация биомассы не возрастает и к концу фазы уменьшается. Количество вновь образовавшихся клеток становится равным количеству отмерших клеток. Популяция постепенно переходит в фазу ускоренного отмирания. Все фазы развития микробной популяции постепенно переходят одна в другую, границы их условны. Если ставится задача получения в периодическом процессе культивирования биомассы продуцента, то процесс целесообразно вести до перехода культуры в фазу замедления роста. Если целевым является продукт метаболизма, то окончание процесса определяется максимальным уровнем накопления метаболита. Каждая популяция характеризуется определенной скоростью роста. Различают общую скорость роста () и удельную (), которая выражает прирост каждой единицы биомассы популяции в единицу времени. Любая микробная популяция при росте удваивает свою биомассу за определенный промежуток времени, который называется временем генерации. Лог-фаза является наиболее удобной для математического описания процесса роста популяции. Если принять, что начальная концентрация биомассы x0, то через n генераций . Если n = τ : g, где τ – время роста, g – время генерации, то . Отсюда можно определить экспериментальным путем время генерации: Для лог-фазы скорость роста популяции выражается зависимостью: , или в интегральной форме: Логарифмируя эту формулу, получаем выражение: , или Сравнивая выражения (1) и (2), получаем: Характерными негативными особенностями периодического процесса являются: цикличность операций, низкая производительность оборудования, сложность автоматизации процесса, нестабильность физиологического состояния популяции микроорганизмов. Однако периодический способ культивирования микроорганизмов широко применяется при получении аминокислот, антибиотиков, ферментных препаратов и других продуктов микробного синтеза. Сложность обеспечения асептических условий при непрерывном культивировании микроорганизмов обусловливает широкое использование периодического метода в ряде производств. Преимущество периодического способа – высокая надежность при проведении ферментационного процесса в условиях асептики. Условием непрерывного глубинного культивирования микробной популяции является непрерывное поступление питательной среды в ферментатор с одновременным непрерывным отбором из аппарата культуральной жидкости с приросшей биомассой и продуктами метаболизма. Процесс протекает в условиях установившегося режима и позволяет поддерживать необходимое физиологическое состояние микробной популяции при постоянных параметрах процесса (концентрация биомассы, субстрата  и продуктов метаболизма и т. д.). Периодическую культуру можно перевести в непрерывную и застабилизировать на длительное время практически в любой точке s-образной кривой. Для промышленного процесса наибольшее значение имеет фаза замедления роста. При большой скорости роста микробной популяции в этой фазе достигается высокая степень утилизации субстрата. Различают одноступенчатые и многоступенчатые процессы непрерывного культивирования. При одноступенчатом непрерывном культивировании микробная популяция развивается в одном ферментаторе, в котором все компоненты питательной среды и микроорганизмы равномерно распределены по всему объему аппарата. При многоступенчатом непрерывном культивировании процесс протекает в батарее соединенных между собой ферментаторов, через которые непрерывно протекает питательная среда. В этом случае в каждом ферментаторе поддерживаются определенные условия для роста сформировавшейся популяции. В производственных условиях накопление биомассы микроорганизмов осуществляют непрерывным культивированием в режиме хемостата. В этом случае скорость роста и плотность популяции ограничивается концентрацией лимитирующего субстрата, поступление которого в ферментатор регулируется изменением скорости протока среды. На практике пользуются параметром, называемым скоростью (коэффициентом) разбавления среды D, ч−1, который определяется по следующему выражению: где F – скорость протока среды, м3/ч; V– полезный объем ферментатора, м3. Величина D характеризует долю объема жидкости в ферментаторе, заменяемой на свежую питательную среду за один час. При непрерывном культивировании в экспоненциальной фазе скорость прироста биомассы определяется выражением а скорость вымывания культуры составляет Скорость изменения концентрации микробной суспензии в ферментаторе складывается из суммы этих величин При установившемся режиме непрерывного культивирования популяция находится в состоянии динамического равновесия, при котором . Следовательно,  и . Это означает, что в стабилизированной проточной культуре удельная скорость роста популяции равна скорости разбавления. Величина  (или ) выражает количество биомассы, г/(дм3˙ч), продуцируемой в единицу времени в единице объема среды, и называется продуктивностью культуры. Изучая рост микробной популяции в хемостате, Моно установил, что зависимость скорости роста от концентрации субстрата можно описать уравнением, напоминающим уравнение Михаэлиса − Ментен, применяемое в ферментативной кинетике где μmax – максимальная удельная скорость роста культуры при отсутствии лимитации субстратом; S – концентрация субстрата в среде; Ks – константа насыщения для субстрата, численно равная концентрации лимитирующего субстрата, при которой . Значение Ks для многих микроорганизмов имеет небольшую величину. При культивировании дрожжей Candida scottii на среде с глюкозой константа насыщения составляет 30–35 мг/дм3. Поскольку в уравнении Моно величина , то удельная скорость роста популяции всегда ниже теоретически возможной. Уравнение Моно получило наибольшее признание из нескольких альтернативных моделей, описывающих зависимость скорости роста от концентрации субстрата. Оно базируется на ряде упрощающих допущений, которые приемлемы для многих, но не для всех систем. Концентрация субстрата не является единственным фактором, лимитирующим скорость роста микроорганизмов. По мере потребления питательных веществ среда обогащается продуктами метаболизма, которые также могут лимитировать рост культуры. Н. Д. Иерусалимский установил, что при высокой плотности популяции рост культуры затормаживают продукты метаболизма. Тогда где P – концентрация продуктов обмена; Kp – константа, численно равная концентрации продуктов метаболизма, при которой скорость роста вдвое меньше максимальной. Из уравнения следует, что если S >> Ks, то скорость роста лимитируется продуктами обмена. В условиях, когда Kp >> P, скорость роста ограничена концентрацией субстрата. На практике рост культуры микроорганизмов зависит еще от целого ряда других факторов: величины рН, температуры, концентрации в среде ингибиторов и растворенного кислорода и т. д. Для хемостата баланс лимитирующего субстрата можно представить следующим уравнением: где.D – скорость разбавления; S0 и S – концентрации лимитирующего субстрата соответственно в поступающей среде и в ферментаторе; y – экономический коэффициент; – скорость изменения концентрации субстрата в ферментаторе. Выражение DS0 характеризует приток субстрата, DS – количество субстрата, удаляемого с культуральной жидкостью, – количество потребленного субстрата. В состоянии динамического равновесия системы , а . Следовательно, или Из уравнения Моно или С учетом этого можем записать где Dс – критическая скорость разбавления, соответствующая максимальной удельной скорости роста μmax. Из приведенных уравнений видно, что когда D приближается к μmax, концентрация лимитирующего субстрата S резко возрастает и стремится к бесконечности (на практике S ≤ S0, т. е. S → S0). Однако, когда D → μmax и S → S0, то значение X стремится к нулю. Следовательно, в этих условиях происходит вымывание культуры и поддержание скорости разбавления, равной максимальной удельной скорости роста, невозможно. На рис. 4.7 представлено влияние скорости разбавления на основные показатели хемостатной культуры: плотность популяции, продолжительность удвоения биомассы, концентрацию лимитирующего субстрата в культуральной жидкости и продуктивность культуры. С увеличением скорости разбавления от нуля до величины, близкой к критической, плотность популяции меняется незначительно. Это связано с тем, что на увеличение скорости протока культура отвечает повышением скорости роста (продолжительность удвоения биомассы уменьшается), и плотность популяции возрастает. Концентрация субстрата в ферментаторе в широком диапазоне скорости разбавления близка к нулю. Когда скорость разбавления приближается к критической (при этом μ → μmax), резко усиливается вымывание культуры из ферментатора. Следовательно, устойчивое состояние хемостатной культуры невозможно при максимальной скорости роста в связи с вымыванием культуры при малейшем увеличении скорости протока. Стабильность динамического равновесия культуры в хемостате достигается тем, что ее рост лимитирован концентрацией субстрата. При условии, что μ < μmax, хемостат работает как устойчивая саморегулирующаяся система. Рис. 4.7. Теоретическая зависимость показателей роста культуры в хемостате от скорости разбавления среды: 1 – концентрация субстрата; 2 – продуктивность культуры D х; 3 – продолжительность удвоения tуд; 4 – плотность популяции х Продуктивность популяции достигает максимального значения при величине скорости разбавления Dm, близкой к критической. Численное значение Dm, при котором D X максимально, можно рассчитать по следующей формуле: Показатели μmax, Ks, у, необходимые для управления процессом непрерывного культивирования, находят экспериментальным путем при периодическом или непрерывном культивировании микроорганизмов. Для определения Ks и μmax производят выращивание культуры при двух скоростях протока (D1 и D2) и измеряют соответствующие им концентрации субстрата в культуральной жидкости (S1 и S2). Учитывая, что константа насыщения Ks не зависит от скорости разбавления, величины μmax и Ks находят из системы тождественных уравнений В некоторых микробиологических производствах (например, в производстве бактериальных средств защиты растений) важное значение имеет синхронность развития культуры. В синхронной культуре все клетки делятся одновременно. В естественных культурах такое явление не наблюдается. Даже в экспоненциальной фазе развития популяции в культуре содержатся клетки, находящиеся на разных стадиях роста. Синхронное деление клеток вызывают искусственно, воздействуя на культуру различными факторами. Распространенными методами синхронизации являются: воздействие пониженной (субоптимальной) или повышенной (супероптимальной) температуры; вынужденное голодание; отбор клеток одинакового размера фильтрованием культуральной жидкости через специальные фильтры; центрифугирование. Чаще применяют простой в исполнении метод воздействия температурой. Неблагоприятная температура культивирования в большей степени затормаживает развитие более чувствительных делящихся клеток. За это время к делению подготавливаются другие клетки, и таким образом достигается синхронность в развитии культуры. PAGE  35 в условиях асептики нестерильный процесс Твердофазное аэробное анаэробное методом полного смешения по методу вытеснения Поверхностное Жидкофазное Глубинное Культивирование микроорганизмов периодическое с подпиткой отъемно-доливное непрерывное