Микроскопия

Микроскопия является одной из основных техник в микробиологическом исследовании [1,2]. Микроскопия подразделяется на несколько видов: световая (оптическая), электронная, рентгеновская и предназначается для наблюдения и регистрации увеличенных изображений образца. Основным видом микроскопии, используемым в бактериологической практике, является световая микроскопия и ее разновидности, ввиду простоты техники и доступности методики.

С помощью современного биологического микроскопа можно получить увеличение до 2500 раз и провести идентификацию объекта, рассмотрев его морфологические особенности. Современный световой микроскоп позволяет рассмотреть объекты величиной не менее 0,2–0,3 мкм. Поскольку живые микроорганизмы прозрачны и плохо видны в проходящем свете, то для детального изучения обычно используют фиксированные и окрашенные бактерии. Можно использовать также препараты живых бактерий, в каплю суспензии которых добавлен определенный краситель (метиленовый синий, генцианвиолет, йод и др.).

1. Световая микроскопия

В световой микроскопии лучи света от микрообъекта, проходя через систему собирательных линз – объектив и окуляр, дают в соответствии с законами оптики увеличенное изображение изучаемого образца. Пучок света, проходящий через исследуемый образец или отраженный от него, меняет одну или несколько характеристик (длину волны, интенсивность, фазу или плоскость поляризации), что сопровождается различными оптическими эффектами – поглощением, отражением, преломлением, дифракцией, интерференцией, дисперсией, люминесценцией и другими, которые в совокупности и составляют изображение.

В настоящее время световая микроскопия – это целый комплекс методов, использующих различные оптические эффекты.

Виды световой микроскопии

1. Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами.

2. Темнопольная микроскопия (микроскопия в темном поле).

В данном методе используют специальный конденсор, который пропускает только краевые лучи источника света, косонаправленные.

Препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо). Для микроскопирования в темном поле на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю иммерсионного масла, а на столик помещают предметное стекло с объектом (чтобы не появились пузырьки воздуха). На покровное стекло также наносят каплю масла. Таким образом, нанеся масло на обе поверхности препарата, достигают однородности среды для проходящих лучей света. Одинаковый коэффициент преломления обеспечивает четкость изображения объекта, а темное поле позволяет лучше рассмотреть мелкие детали клетки бактерий.

3. Люминесцентная микроскопия

Метод люминесцентной микроскопии основан на том, что объект, освещаемый коротковолновым светом (синим или УФ), способен к свечению. Причем если он содержит химические вещества, флюоресцирующие при действии на них коротковолнового света, имеет место первичная люминесценция. Обычно используют явление вторичной люминесценции, когда свечение объекта происходит после обработки его специальными красителями – флюорохромами. К ним относятся акридиновый желтый, оранжевый и т. д.

Главное преимущество метода состоит в том, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях.

Для люминесцентной микроскопии используют обычный микроскоп с набором светофильтров и источником УФ. Первый фильтр – синий, пропускающий длинноволновую