Лекции по "Генной инженерии"

1.Генная инженерия: предмет, задачи.

Предмет: соединение фрагментов ДНК природного и синтетического происхождения или их комбинация in vitro и последующее введение полученных рекомбинантных структур в живую клетку.

Задача: создание принципиально нового биообъекта для биотехнологического производства – микроорганизма с человеческим геномом.
Генная инженерия: методы, общая характеристика.

Материалы для получения рекомбинантных клеток:

Генетический материал (клетка-хозяин);

Транспортное устройство – вектор, переносящий генетический материал в клетку;

Набор специфических ферментов – «инструменты» генной инженерии

Требования к потенциальному продуценту (биообъекту).

1) микроорганизм должен быть непатогенным или обладать  умеренной патогенностью.

2) В целевом продукте не должно быть следов микробного токсина.

3) У микроорганизма должен быть наиболее полно изученный геном.

4) Микроорганизм должен расти на простых и дешевых питательных средах.

5) Проникший в клетку вектор с чужеродным для нее геном не должен расщепляется ферментами этой клетки, но должен восприниматься рибосомами.

6) Образовавшийся чужеродный белок не должен расщепляться ферментами клетки

7) Желательно, чтобы чужеродный белок выводился из клетки продуцента, что облегчит его очистку.

2. Создание биообъектов методами генетической инженерии

Первый этап: к гену кодирующему целевой белок присоединяется нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерную последовательность аминокислот (ЛПА/К). С помощью ЛПА/К белок проходит слои цитоплазматической мембраны из клетки наружу. Для этого в мембране клетки должна находится «сигнальная протеаза», отщепляющая от генного продукта ЛПА/К перед его выходом в среду.

Первый этап

Второй этап: обработка  клеток микроорганизмов солями лития и кальция. В результате в клеточной стенке формируются отверстия («дырки»), через которые проникают молекулы вектора.

Обработанные таким путем клетки называют компетентными.

Векторы конструируются чаще всего на основе умеренных фагов или плазмид.

Третий этап: встраивание гена (ДНК) в вектор происходит при помощи ферментов – эндонуклеаз. Рабочий термин рестриктазы (от англ. restriction - разрезание).

Рестриктазы разрезают нить ДНК, например, между G и A. В результате образуются комплементарные нити ДНК с одинаковой нуклеотидной последовательностью на концах, создаются одинаковые участки – «липкие концы». Образно говоря в двунитевой ДНК появляется щель, в эту щель может быть встроен ген – фрагмент ДНК.

Четвертый этап: вектор с прочно закрепленным геном вводится в микробную клетку.

Пятый этап: проводят отбор рекомбинантных продуцентов.

Разработан метод предварительного отбора клонов, содержащих вектор. Вводится понятие гена-маркера. Этот ген занимает свое место в векторе вместе с «рабочим» геном.

Примером маркера может быть ген, кодирующий фермент беталактамазу.

Клетки микроорганизмов (м/о) высевают на твердую питательную среду с ампициллином. Появление на среде колоний м/о означает, что ампициллин был разрушен беталактамазой. Беталактамаза может кодироваться только геном находящимся в векторе, т.к. в исходных клетках такого гена нет. Это означает, что в вектор помимо гена-маркера был включен и ген, кодирующий целевой продукт.

3. Рекомбинантные белки как лекарственные средства

В качестве продуцентов рекомбинантных белков используются: Escherichia coli  (кишечная палочка), Bacillus subtilis (синегнойная палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи).

Существуют правила работы с рекомбинантными м/о. Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровнях.

На генетическом уровне:

В геном продуцента вводится изменение – из него удаляются некоторые гены, например, участвующие с синтезе аминокислот, необходимые для роста м/о. Если такие клетки попадают в окружающую среду, то они не размножаются. Опасность заражения территории предприятия значительно уменьшается.