Essays.club - Получите бесплатные рефераты, курсовые работы и научные статьи
Поиск

Fluorescent HTP antiparasitic drug screens

Автор:   •  Октябрь 25, 2022  •  Доклад  •  3,011 Слов (13 Страниц)  •  131 Просмотры

Страница 1 из 13

Fluorescent HTP antiparasitic drug screens

Genetically engineered yeast can be used to express antiparasitic targets and its human orthologues to facilitate quicker identification of potential therapeutic compounds by HTS, supplying composite activity and toxicity in human cells at once. Scientists cloned a series of potential drug targets of P. falciparum, P. vivax, Schistosoma mansoni, Leishmania major, Trypanosoma brucei, T. cruzi and Brugia malayi  into yeast expression vectors under the control of a TetO2 regulatable promoter. In parallel, the authors cloned the human counterpart for each of the targets to be used as an internal control for specificity. 

They constructed yeast strains and designed experimental conditions making them dependent of the functional expression of each of the heterologous target, and then characterized the fitness of each engineered strain. These were then labeled with high-copy plasmids expressing one of four different fluorescent proteins: mCherry , CFP, Venus or Sapphire. Such labeling of yeast cells with distinct fluorophores allows quantitation of growth of the two to four different strains in competition in presence of different library compounds, providing an internal control for general toxicity as well as plate positioning effects. The setup thus enables rapid identification of chemical inhibitors with selectivity for the parasite target protein over the human ortholog (Fig. 1).

These strains were successfully used in screens using chemical libraries with high diversity, libraries of FDA approved compounds and the Malaria Box collection of 400 compounds with antiplasmodial activity.

 The hits identified by this approach have low general cytotoxicity and a higher specificity for the parasite target when compared to the human counterpart, with approximately 50% of the compounds identified in yeast-based screens do kill the parasites efficiently in vitro. This approach is particularly interesting for targets from parasites that cannot be cultivated in vitro. Furthermore, it selects compounds able to cross the plasma membrane of eukaryotic cells and which are specific to the parasite target, not inhibiting the human counterpart, suggesting low general toxicity.

Генетически модифицированные дрожжи можно использовать для экспрессии противопаразитарных мишеней и их человеческих ортологов, чтобы облегчить более быструю идентификацию потенциальных терапевтических соединений с помощью HTS, одновременно обеспечивая комбинированную активность и токсичность в клетках человека. Ученые клонировали ряд потенциальных мишеней для лекарств P. falciparum, P. .vivax, Schistosoma mansoni, Leishmania major, Trypanosoma brucei, T. cruzi и Brugia malayi в векторы экспрессии дрожжей под контролем регулируемого промотора TetO2. Параллельно авторы клонировали человеческий аналог каждой из мишеней для использования в качестве внутреннего контроля специфичности.

Они сконструировали штаммы дрожжей и спроектировали экспериментальные условия, сделав их зависимыми от функциональной экспрессии каждой из гетерологичных мишеней, а затем охарактеризовали приспособленность каждого сконструированного штамма. Затем они были помечены высококопийными плазмидами, экспрессирующими один из четырех различных флуоресцентных белков: mCherry, CFP, Venus или Sapphire. Такая маркировка дрожжевых клеток разными флуорофорами позволяет количественно оценить рост двух-четырех различных штаммов в условиях конкуренции в присутствии различных соединений библиотеки, обеспечивая внутренний контроль общей токсичности, а также эффектов позиционирования планшета. Таким образом, установка позволяет быстро идентифицировать химические ингибиторы с селективностью в отношении белка-мишени паразита по сравнению с человеческим ортологом (рис. 1).

Эти штаммы были успешно использованы в скрининге с использованием химических библиотек с большим разнообразием, библиотек соединений, одобренных FDA, и коллекции Malaria Box из 400 соединений с антиплазмодиальной активностью.

Попадания, выявленные с помощью этого подхода, имеют низкую общую цитотоксичность и более высокую специфичность в отношении паразита-мишени по сравнению с человеческим аналогом, при этом примерно 50% соединений, идентифицированных при скрининге на основе дрожжей, действительно эффективно убивают паразитов in vitro. Этот подход особенно интересен для мишеней от паразитов, которые нельзя культивировать in vitro. Кроме того, он отбирает соединения, способные проникать через плазматическую мембрану эукариотических клеток и являющиеся специфичными в отношении паразита-мишени, не ингибируя человеческий аналог, что предполагает низкую общую токсичность.

...

Скачать:   txt (32.1 Kb)   pdf (155.3 Kb)   docx (18.5 Kb)  
Продолжить читать еще 12 страниц(ы) »
Доступно только на Essays.club