Электронная микроскопия в диагностике вирусных болезней

Занятие 22.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ  БОЛЕЗНЕЙ

Цель занятия: ознакомить студентов с устройством электронного микроскопа и использованием электронной микроскопии в диагностике вирусных болезней.

Методические указания. Устройство электронного микроскопа. Создание электронного микроскопа связано с открытием электронов, их волновой природы и способности отклоняться от своего первоначального пути при прохождении через магнитные и электростатические поля. Таким образом, электрические и магнитные поля могут фокусировать пучок движущихся электронов и действовать на них, как действуют обычные стеклянные линзы в световом микроскопе.

В 1931 г. немецкие ученые Кноль и Руска создали первый в мире просвечивающий электронный микроскоп. Источником электронов в электронном микроскопе служит нить накаливания — катод. Электроны, испускаемые катодом, ускоряются в электрическом поле с разностью потенциалов между катодом и анодом от нескольких десятков до сотен тысяч вольт в глубоком вакууме (до 10-6 мм рт. ст.). Магнитное поле конденсорной линзы сужает поток электронов в пучок, который проходит через исследуемый объект. При этом траектория движения электронов отклоняется под различными углами. Измененный пучок электронов попадает в поле линзы объектива, в котором формируется первичное промежуточное увеличенное изображение объекта. Это промежуточное изображение объекта увеличивается еще раз с помощью проекционной линзы и создает конечное изображение объекта. Конечное изображение возникает на флуоресцирующем экране и может быть экспонировано на фотопластинку или фотопленку. В современных электронных микроскопах первого класса максимальное увеличение достигает 2 000 000, а гарантируемое разрешаемое расстояние ±0,14 нм.

По характеру исследования объектов различают микроскопы просвечивающего типа, сканирующие, эмиссионные, теневые. Наиболее распространены электромагнитные микроскопы просвечивающего типа.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. При работе с электронным микроскопом важное значение имеет каждый этап приготовления препаратов. Для просвечивающего электронного микроскопа исследуемые объекты должны быть в виде очень тонких срезов (до 40...60 нм) или вирусных суспензий, которые помещают на специальные медные сетки, или бленды. Для удержания суспензий над отверстиями сетки ее покрывают тонкой пленкой-подложкой, изготовленной из коллодия, и укрепляют напылением углерода.

Различные структуры биологических объектов и пленка- подложка почти в одинаковой степени рассеивают электроны, и изображение объекта не будет выявлено. Поэтому необходимо предварительно создать различную электронную плотность между фоном и препаратом или между структурами биологических объектов. В качестве контрастирующих веществ наиболее широкое распространение получили 1...2%-ные водные растворы фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой, осмиевой кислоты, растворы уранилацетата и уксуснокислого свинца. Методы негативного и позитивного контрастирования широко применяют при исследовании биологических объектов в виде суспензий.

При негативном контрастировании контрастирующее вещество высокой электронной плотности окружает объект более низкой плотности и он становится видным на более плотном окружающем его фоне. Время контрастирования препарата составляет секунды (в среднем 15...40 с). Для получения позитивного контрастирования время реагирования контрастирующего вещества с объектом измеряется в минутах и часах. Соединяясь с определенным веществом объекта, атомы и молекулы тяжелых металлов повышают контрастность соответствующих структур, обеспечивая позитивное контрастирование объекта. При позитивном контрастировании избыток контрастирующего вещества фона объекта удаляется промыванием дистиллированной водой, и объект выглядит более плотным на более светлом окружающем фоне.